無細(xì)胞體系中胞壁酸合成途徑的構(gòu)建及反義寡核苷酸抑制作用的研究.pdf

1、無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系是一種體外合成蛋白質(zhì)的開放系統(tǒng)，沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的限制，因此，與傳統(tǒng)體內(nèi)蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比，在蛋白質(zhì)合成方面具有許多優(yōu)勢，如反應(yīng)條件容易控制，操作簡單方便，容易實現(xiàn)高通量反應(yīng)等。本文主要開展無細(xì)胞體系同時合成多種細(xì)胞壁肽聚糖合成酶并用于體外重建胞壁酸合成途徑的研究，探索無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)在體外合成生物學(xué)和無細(xì)胞生物學(xué)方面的應(yīng)用潛力。
　　細(xì)胞壁肽聚糖合成途徑的相關(guān)酶蛋白在大多數(shù)細(xì)菌中保守度高，是開發(fā)廣譜新抗生素的重要

2、靶點。然而，傳統(tǒng)胞壁酸合成途徑存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，難以用傳統(tǒng)方法進(jìn)行抑制劑的高效篩選。本論文在體外無細(xì)胞蛋白合成體系中，通過添加胞壁酸合成酶基因PCR產(chǎn)物作為線性模板，實現(xiàn)了6種關(guān)鍵酶基因(MurA-MurF)的可溶性共表達(dá)。進(jìn)一步加入MurA-MurF所需的各種底物后，采用HPLC檢控每一步酶反應(yīng)的中間產(chǎn)物，并使用HPLC-ESI-MS測定各個中間產(chǎn)物的性質(zhì)，確證了這一多酶反應(yīng)終產(chǎn)物（UDP-MurNAc-L-Ala-γ-D-Glu-me

3、so-2，6-diaminopimeloyl-D-Ala-D-Ala）。這一研究工作不僅實現(xiàn)了胞壁酸合成途徑的體外重構(gòu)，而且將多靶點抗生素高通量篩選方法從體內(nèi)向體外方向轉(zhuǎn)變。
　　反義寡核苷酸在細(xì)菌的代謝調(diào)控和生物醫(yī)藥領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價值。本課題利用體外構(gòu)建的胞壁酸合成途徑，開展高效篩選能有效抑制MurA-MurF表達(dá)的反義寡核苷酸的研究。首先通過計算機輔助識別目標(biāo)mRNA結(jié)構(gòu)的模擬，針對以上6種目標(biāo)酶蛋白基因共設(shè)計27條反義寡

4、核苷酸，然后檢測各種反義寡核苷酸對目標(biāo)蛋白表達(dá)的抑制作用。結(jié)果表明，在設(shè)計的27條反義寡核苷酸中，有10條寡核苷酸對各自目標(biāo)基因表達(dá)的抑制作用達(dá)到了90％以上。然后重點研究了反義寡核苷酸A281和B139分別對MurA和MurB的抑制劑量效應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)目標(biāo)基因線性模板濃度為10 ng/μL條件下，40μM反義寡核苷酸能夠完全抑制MurA或MurB的表達(dá)，從而在體外實現(xiàn)對胞壁酸合成途徑的阻斷。這一工作進(jìn)一步佐證了這一復(fù)雜多酶催化途徑在

5、無細(xì)胞體系中的成功重建，而且這些篩選出的反義寡核苷酸具有成為新抗菌藥物的潛力。
　　無細(xì)胞體系的合成效率和相應(yīng)試劑盒的工具性是制約無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵性抑制因素。在實驗室長期的無細(xì)胞體系制備基礎(chǔ)上，通過在無細(xì)胞制備宿主中表達(dá)肌酸激酶和T7 RNA聚合酶，能夠簡化無細(xì)胞體系的制備和降低成本，可應(yīng)用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成試劑盒研制。同時構(gòu)建了無細(xì)胞連續(xù)交換連續(xù)反應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)，并制作了基于24孔板的CECF無細(xì)胞反應(yīng)器，能夠用