乙酰肝素酶反義寡核苷酸對惡性黑素瘤生長抑制作用的實驗研究.pdf

1、乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)是一種新近克隆成功的葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，也是體內(nèi)惟一能夠降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycan．HSPG)的內(nèi)切糖苷酶，通過降解HSPG，破壞細胞外基質(zhì)和基底膜結構，在腫瘤的浸潤和轉移中起重要作用。目前研究證明，Hpa mRNA和蛋白在多種惡性腫瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤及惡性黑素瘤等組織中的表達異常增高，并且證實

2、其表達水平增高與腫瘤的侵襲、轉移潛能以及患者的預后密切相關；最新研究顯示，Hpa與卵巢癌、胃癌等腫瘤的生長、增殖及凋亡亦密切相關。但是，有關Hpa對惡性黑素瘤生長調(diào)控的相關研究，特別是以Hpa基因為靶點的反義寡核苷酸技術抑制惡性黑素瘤細胞生長的研究，國內(nèi)外均未見文獻報道。 惡性黑素瘤(Malignant melanoma，MM)是一種常見的黑素細胞腫瘤，具有惡性程度高、極易發(fā)生早期侵襲和轉移以及死亡率高等臨床特點，在所有惡性腫瘤

3、中占1％～2％。有資料顯示，本病晚期患者的平均生存期僅為6～10月。近年來，世界范圍內(nèi)的惡性黑素瘤發(fā)病率呈明顯增長趨勢。2006年最新報告顯示，黑素瘤已成為美國第7位最常見的惡性腫瘤；澳大利亞每年每10萬人中有40～60例為新發(fā)病例； 1981年～2000年間，我國皮膚惡性黑素瘤亦有明顯增加，平均年增長率達3.9％。目前，雖然在Mohs顯微外科手術、化療、放療以及免疫治療等方面進行了大量的臨床與實驗研究，但療效常不十分理想。因此，惡性黑

4、素瘤的防治在醫(yī)學領域始終是一個國際性的難題和研究熱點。近年，隨著反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)基因治療技術的飛速發(fā)展，以其設計簡單、合成容易、安全性高、特異性強等突出特點已成為腫瘤基因治療研究領域的熱點課題。為研究Hpa與惡性黑素瘤生長和腫瘤細胞增殖的關系，探討惡性黑素瘤基因治療的有效方法，本研究應用陽離子脂質(zhì)體介導的乙酰肝素酶反義寡核苷酸(Hpa-ASODN)下調(diào)靶基因表達的

5、治療策略，采用細胞培養(yǎng)、異種移植瘤動物實驗、RT-PCR、原位雜交和免疫組織化學等多種實驗方法，對惡性黑素瘤中Hpa mRNA和蛋白的表達以及Hpa-ASODN對惡性黑素瘤腫瘤生長和腫瘤細胞增殖的影響及其機制進行了一系列體外和體內(nèi)實驗研究。 本研究共分三個部分。 第一部分惡性黑素瘤中乙酰肝素酶mRNA和蛋白表達的研究 目的： 觀察良、惡性黑素細胞腫瘤中Hpa mRNA和蛋白表達的差異，探討Hpa與惡性黑素

6、瘤發(fā)生發(fā)展的關系。 方法： 1.采用原位雜交和免疫組織化學(SP法，AEC顯色)兩種實驗方法在基因水平和蛋白水平上對30例惡性黑素瘤組織、人惡性黑素瘤A375細胞株、30例黑素細胞痣組織及15例正常皮膚組織中：Hpa的tuRNA和蛋白表達進行檢測。 2.采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行X<'2>檢驗，檢驗標準α=0.05。 第二部分乙酰肝素酶反義寡核苷酸體外抑制惡性黑素瘤A375細胞增殖的實驗研究

7、 目的： 觀察Hpa-ASODN轉染對體外培養(yǎng)的人惡性黑素瘤A375細胞增殖的影響，檢測轉染對A375細胞Hpa mRNA和蛋白表達的影響；篩選ASODN最佳有效序列，探討Hpa-ASODN對A375細胞增殖的調(diào)控作用及可能機制，為裸鼠體內(nèi)試驗奠定基礎。 方法： 1.設計、合成針對ttpa mRNA的ASODN-t1、ASODN-t2、ASODN-t3、ASODN-t4 4條反義寡核苷酸鏈和1條無關寡核苷酸鏈(

8、N-ODN)，制備各自10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L濃度的寡核苷酸(ODN)陽離子脂質(zhì)體包裹體，分別轉染體外培養(yǎng)的惡性黑素瘤A375細胞株，以培養(yǎng)液代替ODN作為對照； 2.采用倒置相差顯微鏡和常規(guī)HE染色觀察每條鏈各濃度組轉染后細胞的生長情況及形態(tài)學改變；采用臺盼藍排斥試驗檢測細胞增殖。 3.采用原位雜交與免疫組織化學(SP法，AEC顯色)兩種實驗方法檢測轉染后抑制細胞增殖最強序列的ASODN組(

9、30μmol/LASODN-t2)、N-ODN組及對照組3組細胞Hpa mRNA和蛋白表達水平。 4.數(shù)據(jù)用X±S表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析和q檢驗，檢驗水準α=0.05。 第三部分乙酰肝素酶反義寡核苷酸對裸鼠惡性黑素瘤移植瘤生長的抑制作用及機制研究 目的： 建立Hpa-ASODN轉染的人惡性黑素瘤A375細胞異種移植瘤實驗動物模型；觀察Hpa-ASODN對裸鼠體內(nèi)人惡性黑素瘤皮下移

10、植瘤生長的影響；檢測移植瘤Hpa mRNA和蛋白、VEGF和bFGF蛋白表達的改變，進一步探討Hpa-ASODN對裸鼠體內(nèi)人惡性黑素瘤移植瘤生長的抑制作用及可能機制。 方法： 1.選擇25只雌性BALB/c裸鼠，每組5只，分為5組；分別采用10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L ASODN-t2和30μmol/L N-ODN的陽離子脂質(zhì)體轉染人惡性黑素瘤A375細胞，用培養(yǎng)液代替ODN作為對照，以轉染細胞皮

11、下注射的方式進行裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，建立人惡性黑素瘤A375細胞異種移植瘤動物模型；用游標卡尺測量并計算移植瘤體積；6周后處死荷瘤裸鼠，HE染色觀察組織學形態(tài)。 2.采用RT-PCR、原位雜交及免疫組織化學(SP法，DAB顯色)三種實驗方法檢測上述5組移植瘤Hpa mRNA和蛋白表達的變化。 3.采用免疫組織化學(SP法，DAB顯色)方法檢測30μmol/L ASODN-t2組、30μmol/L N-ODN組及對照組腫瘤組

12、織VEGF和bFGF蛋白表達水平的變化。 4.數(shù)據(jù)用X+S表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析和q檢驗，檢驗水準α=0.05。 結論 1.惡性黑素瘤組織中Hpa mRNA和蛋白均呈高表達，其陽性表達率均顯著高于黑素細胞痣和正常皮膚，且Hpa mRNA和蛋白的陽性表達高度一致。提示Hpa在惡性黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著重要作用，有可能成為惡性黑素瘤的診斷指標及治療靶點之一。 2.首次檢測了

13、惡性黑素瘤A375細胞株中Hpa mRNA和蛋白的表達，結果顯示其Hpa mRNA和蛋白亦呈高表達，表明該細胞株可作為體內(nèi)外研究惡性黑素瘤與Hpa，關系的靶細胞系。 3．Hpa—ASODN對體外培養(yǎng)的．A375細胞增殖有抑制作用，且有濃度依賴效應，證明Hpa—ASODN具有體外抗惡性黑素瘤的活性。 4．Hpa—ASODN可下調(diào)A375細胞Hpa mRNA和蛋白的表達，提示Hpa的表達下調(diào)可能是引起A375細胞增殖抑制作用

14、機制之一。 5．首次成功建立了A375細胞裸鼠皮下移植瘤模型，提示該裸鼠移植瘤模型可作為今后研究惡性黑素瘤與Hpa關系的動物模型。 6．率先證實Hpa—ASODN可明顯抑制裸鼠移植瘤生長，并可下調(diào)裸鼠移植瘤組織中Hpa mRNA和蛋白的表達，提示Hpa—ASODN具有體內(nèi)抗惡性黑素瘤的作用。 7．首次發(fā)現(xiàn)Hpa-ASODN可下調(diào)裸鼠移植瘤組織中VEGF和bFGF的表達，提示Hpa-ASODN可能具有抑制腫瘤血管生