microR-21反義寡核苷酸對人大腸癌HT-29細胞生長抑制作用及化放療敏感性的影響.pdf

1、目的:
　　觀察慢病毒介導miR-21反義寡核苷酸下調(diào)大腸癌HT-29細胞內(nèi)miR-21表達對大腸癌細胞生物學行為及化放療敏感性的影響。探討miR-21成為大腸癌靶向治療的新靶點的可能性。
　　方法:
　　構(gòu)建含miR-21反義寡核苷酸的慢病毒載體，通過慢病毒感染將miR-21ASO片段導入大腸癌HT-29細胞內(nèi)下調(diào)miR-21表達，將轉(zhuǎn)染miR-21ASO組作為實驗組，另設正常HT-29細胞未轉(zhuǎn)染組（Control組

2、）、轉(zhuǎn)染空載慢病毒組(HT-29/NC組)、轉(zhuǎn)染U6snRNA組(HT-29/U6組)為對照組，用探針法PCR檢測各組HT-29細胞內(nèi)miR-21表達差異，驗證經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒載體后，實驗組miR-21表達下調(diào)，再篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株進行后續(xù)各實驗以研究下調(diào)HT-29細胞內(nèi)miR-21表達后其生物學行為的變化以及對放化療敏感性的影響。即通過細胞直接計數(shù)法檢測各組細胞增殖情況，應用流式細胞術(shù)檢測各組細胞細胞周期變化及細胞凋亡率是否有差異，通過

3、細胞克隆形成實驗收集各組細胞克隆形成率來分析細胞克隆形成情況，Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，MTT法檢測不同梯度藥物濃度的腫瘤抑制率，以及經(jīng)總量10GyX線照射后各組腫瘤細胞的生長抑制率。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)染miR-21ASO的實驗組較正常HT-29細胞組miR-21表達明顯下降，具有顯著差異（P值＜0.01）;轉(zhuǎn)染空載慢病毒組及U6snRNA對照組與正常組miR-21表達無明顯差異。
　　2、通過

4、細胞直接計數(shù)法連續(xù)7天分別計數(shù)各組細胞數(shù)目，繪制細胞生長曲線，HT-29/ASO組細胞增殖速率相較于其他各對照組細胞明顯更低，(P值＜0.01)，而Control組、NC組、U6組各組間無顯著差異。
　　3、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-21ASO后細胞早期凋亡率較對照組明顯增加，G0/G1期所占細胞總數(shù)百分比上升，而S期細胞百分比下降。
　　4、細胞克隆形成實驗顯示HT-29/ASO組細胞克隆形成率明顯低于HT-29組

5、、HT-29/NC組及HT-29/U6組（P值＜0.01），而HT-29組、HT-29/NC組及HT-29/U6組之間細胞克隆形成率無顯著差異。
　　5、細胞侵襲實驗顯示轉(zhuǎn)染miR-21ASO的實驗組細胞侵襲能力明顯低于對照組，下調(diào)miR-21表達的HT-29/ASO組穿過Matrigel膜的細胞數(shù)最少，與其他各組相比差異有統(tǒng)計學意義（P值＜0.01），HT-29/NC組及HT-29/U6組與未轉(zhuǎn)染慢病毒Control組無明顯差異

6、（P值＞0.05）。
　　6、MTT法檢測下調(diào)miR-21后HT-29細胞對5-FU藥物敏感性實驗顯示，在不同5-FU藥物濃度下，HT-29/ASO轉(zhuǎn)染組細胞的生長抑制率較各對照組細胞生長抑制率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P值＜0.01），HT-29/ASO組增敏倍數(shù)為2.35倍。
　　7、MTT法檢測下調(diào)miR-21后HT-29細胞對放療敏感性實驗，結(jié)果顯示，總量10GyX線照射后HT-29/ASO組腫瘤細胞抑制率明顯高