Livin反義寡核苷酸對膀胱癌細(xì)胞抑制作用的實驗研究.pdf

1、近年來，人們發(fā)現(xiàn)凋亡過程受到抑制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到非常關(guān)鍵的作用。其中IAPs在細(xì)胞的凋亡中扮演非常重要的角色，某些IAPs成員異常高表達(dá)常引起組織細(xì)胞凋亡受阻，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)的人類IAP家族有8個，包括NAIP、ILP-2、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、Bruce、survivin及Livin。其中Livin是最近發(fā)現(xiàn)的IAPs家族新成員，主要在一些腫瘤組織細(xì)胞中高表達(dá)，在正常組織不表達(dá)或極少表達(dá)，可能

2、成為腫瘤治療的靶點。我們的前期研究在膀胱癌患者尿液中也發(fā)現(xiàn)有Livin mRNA的表達(dá)，而健康志愿者無表達(dá)。
　　 目的：
　　 在我們的前期工作基礎(chǔ)上，我們擬利用反義核酸技術(shù)，在體、內(nèi)外阻斷膀胱癌細(xì)胞Livin mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，觀察癌細(xì)胞的生長以及凋亡是否受到影響，以明確Livin在膀胱癌細(xì)胞中的作用，并初步探討其機(jī)制。為以Livin為靶基因的膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 一.

3、設(shè)計、合成全硫代修飾Livin反義寡核苷酸序列及其功能鑒定。
　　 1.參考文獻(xiàn)設(shè)計、篩選、合成全硫代修飾Livin反義寡核苷酸。同時設(shè)計一條錯義序列寡核苷酸作為對照。
　　 2.制作Livin反義寡核苷酸-LipofectamineTM2000復(fù)合物，將其轉(zhuǎn)染入5637膀胱癌細(xì)胞中。
　　 3.熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　 4.用RT-PCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞

4、Livin mRNA及蛋白表達(dá)的變化。
　　 二.細(xì)胞分組
　　 根據(jù)向培養(yǎng)細(xì)胞中加入的成分不同，分為：
　　 （1）反義組：加入反義寡核苷酸；
　　 （2）錯義組：加入錯義的寡核苷酸；
　　 （3）脂質(zhì)體組：只加入等量稀釋的脂質(zhì)體；
　　 （4）PBS（磷酸緩沖液）組：只加入等量的PBS。
　　 三.Livin反義寡核苷酸對人膀胱癌細(xì)胞株5637生物學(xué)活性的影響
　　 1

5、.以不同濃度的Livin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的膀胱癌細(xì)胞，用MTT法測定細(xì)胞增殖活性。從中篩選出適當(dāng)?shù)腖ivin反義寡核苷酸濃度，進(jìn)行下一步實驗。
　　 2.Livin反義寡核苷酸對膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)
　　 ①激光共聚焦顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Livin反義寡核苷酸后的形態(tài)學(xué)變化。
　　 ②AO/EB雙染色、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　

6、 四.Livin反義寡核苷酸誘導(dǎo)荷瘤鼠膀胱癌組織凋亡的研究
　　 1.裸鼠膀胱癌移植瘤模型的建立
　　 采用皮下注射法建立裸鼠膀胱癌移植瘤模型。
　　 2.給藥方法及分組
　　 采用瘤體內(nèi)5點注射法，根據(jù)注射核酸的不同，將裸鼠隨機(jī)分為對照組（瘤體內(nèi)注射錯義寡核苷酸）和反義組（瘤體內(nèi)注射反義寡核苷酸）。
　　 3.Livin反義寡核苷酸對荷瘤鼠腫瘤組織Livin表達(dá)的影響
　　 用RT-P

7、CR、Western blot檢測檢測轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞Livin mRNA及蛋白表達(dá)的變化。
　　 4.Livin反義寡核苷酸對荷瘤鼠腫瘤組織的生物學(xué)效應(yīng)
　　 ①用游標(biāo)卡尺測量、計算腫瘤體積，繪制癌細(xì)胞體內(nèi)生長曲線。接種后第30天剝瘤稱重。
　　 ②H.E染色光鏡觀察腫瘤組織轉(zhuǎn)染Livin反義寡核苷酸后的形態(tài)學(xué)變化。
　　 ③TUNEL法檢測荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況。
　　 ④免疫組化檢測荷瘤鼠腫

8、瘤caspas-3的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 一.Livin反義寡核苷酸能有效轉(zhuǎn)染入膀胱癌細(xì)胞內(nèi)并抑制LivinmRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 將FITC標(biāo)記的Livin ASODN轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察，見約55％的細(xì)胞染上綠色熒光，說明Livin ASODN能有效地轉(zhuǎn)染入5637細(xì)胞中。
　　 RT-PCR擴(kuò)增后顯示5637細(xì)胞表達(dá)livinα和livinβ，但反義組的電泳帶亮度明顯

9、低于錯義組、脂質(zhì)體組及PBS組，而后三組間亮度相似。反義組livin兩個片段的mRNA相對表達(dá)量（0.46±0.05）較錯義組（0.88±0.05）、脂質(zhì)體組（0.92±0.04）、PBS組（0.91±0.06）明顯減弱，P<0.01，而各對照組間比較無顯著性差異，P>0.05。
　　 采用Western blot檢測各組細(xì)胞中l(wèi)ivin蛋白的表達(dá)，結(jié)果反義組livinα和livinβ雜交帶亮度明顯低于錯義組、脂質(zhì)體組和PBS組

10、。
　　 細(xì)胞免疫熒光染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)反義組癌細(xì)胞標(biāo)記livin的綠色熒光明顯減弱，且見有的細(xì)胞體積明顯縮小，完全無綠色熒光。其余各對照組無明顯變化。
　　 說明Livin反義寡核苷酸能有效抑制膀胱癌細(xì)胞Livin mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 二.Livin反義寡核苷酸對人膀胱癌細(xì)胞增殖活性的影響
　　 MTT法發(fā)現(xiàn)Livin反義寡核苷酸能抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖活性，且其抑制作用呈明顯

11、的濃度依賴性。我們據(jù)此選擇160nmol/L的寡核苷酸濃度進(jìn)行下一步實驗。
　　 三.Livin反義寡核苷酸對膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)
　　 ①細(xì)胞形態(tài)的變化：激光共聚焦顯微鏡、透射電子顯微鏡下見反義組可見較多細(xì)胞體積腫大、細(xì)胞器腫脹、變性壞死。有的細(xì)胞體積縮小，發(fā)生凋亡，甚至形成凋亡小體。
　　 ②細(xì)胞凋亡率的變化：AO/EB雙染色、Annexin V-FITC標(biāo)記凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義

12、組的細(xì)胞凋亡率（46.39±9.23）％顯著高于PBS組（4.54±1.84）％、脂質(zhì)體組（5.70±1.61）％及錯義組（5.10±1.56）％，P<0.01。而后三組間凋亡率差異無顯著意義，P>0.05。
　　 三.Livin反義寡核苷酸對荷瘤鼠腫瘤組織的抑制作用
　　 1.Livin反義寡核苷酸對荷瘤鼠腫瘤組織Livin表達(dá)的影響
　　 RT-PCR擴(kuò)增后顯示，反義組荷瘤鼠腫瘤組織表達(dá)livinα和livi

13、nβ的電泳帶亮度明顯低于對照組。
　　 Western blot檢測荷瘤鼠腫瘤組織livin蛋白的表達(dá)，結(jié)果反義組livinα和livinβ雜交帶亮度明顯低于對照組。
　　 免疫組化也顯示反義組livin表達(dá)減弱（其面積積分光密度為：0.1661±0.1028，對照組為0.2490±0.1483，P<0.05）
　　 說明 Livin反義寡核苷酸在體內(nèi)也能有效抑制膀胱癌細(xì)胞LivinmRNA及蛋白的表達(dá)。

14、　　 2.Livin反義寡核苷酸對對荷瘤鼠腫瘤組織的生物學(xué)效應(yīng)
　　 ①腫瘤生長的變化：通過測量、計算腫瘤體積，繪制癌細(xì)胞體內(nèi)生長曲線。發(fā)現(xiàn)從腫瘤接種后的第18天開始至接種后第30天，反義組腫瘤體積顯著小于對照組，P<0.05。接種后第30天剝瘤稱重，反義組瘤塊重量為1.31±0.88g，明顯輕于對照組（2.41±0.41g），P<0.05。說明Livin反義寡核苷酸能在體內(nèi)抑制了腫瘤的生長。
　　 ②H.E染色光鏡觀

15、察腫瘤組織轉(zhuǎn)染Livin反義寡核苷酸后的形態(tài)學(xué)變化：可見反義組腫瘤組織有局灶變性、壞死現(xiàn)象及炎癥細(xì)胞浸潤。
　　 ③腫瘤細(xì)胞凋亡情況：TUNEL法檢測荷瘤鼠腫瘤組織凋亡指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義組為19.60±5.91，明顯高于對照組（3.48±2.35），P<0.05。
　　 ④免疫組化檢測荷瘤鼠腫瘤caspas-3的表達(dá)情況：反義組腫瘤組織caspas-3表達(dá)顯著強(qiáng)于對照組（面積積分光密度分別為：反義組0.4501±0.16

16、18，對照組0.3601±0.1065，P<0.05）。說明Livin反義寡核苷酸抑制了Livin的表達(dá)后，解除了Livin對caspas-3的抑制作用，從而使caspas-3的表達(dá)增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 一.人膀胱癌細(xì)胞株5637表達(dá)Livin兩個異構(gòu)體。
　　 二.Livin在人膀胱癌細(xì)胞的增殖及凋亡過程中扮演重要角色。
　　 三.Livin抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制之一是其抑制了Caspase