鷹嘴豆蛋白樣α-淀粉酶抑制劑的分離純化、候選基因克隆及生物學(xué)特性的研究.pdf

1、鷹嘴豆（CicerαrietinumL.）屬野豌豆族（Vicieαe）鷹嘴豆屬（Cicer），又叫做桃豆、雞豌豆、羊頭豆、腦豆子、諾胡提（維語(yǔ)），在我國(guó)新疆已有2500年的種植歷史。其籽粒營(yíng)養(yǎng)成分全，含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種重要的糧食來(lái)源，并具有一定的藥用價(jià)值。α-淀粉酶抑制劑在植物中普遍存在，由于其對(duì)α-淀粉酶有很強(qiáng)的特異性抑制作用，在植物防止病蟲害侵害等方面具有重要作用。因此，對(duì)鷹嘴豆種子所含α-淀粉酶抑制劑進(jìn)行研究將具有一定重要意

2、義。本論文分別從鷹嘴豆種子中α-淀粉酶抑制劑的提取和抑制活性測(cè)定、不同品種間的差異分析、分離純化、基因克隆、子葉和胚中的抑制活性的分析、生物學(xué)特性、酶學(xué)特性以及抗氧化特性方面進(jìn)行了研究。其主要結(jié)論如下：
　　 一、以人的唾液α-淀粉酶(HSA)為示蹤檢測(cè)劑，以淀粉為底物，通過(guò)DNS法，對(duì)鷹嘴豆種子中的α-淀粉酶抑制劑的粗提取影響因素進(jìn)行了探討，結(jié)果表明：以20mmol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液作提取液，料液比為1:

3、5(WN)時(shí)，提取液抑制活力最大；70℃水浴5min時(shí)，提取液抑制活力保存最大。
　　 二、比較34個(gè)鷹嘴豆品種的α-淀粉酶抑制劑抑制活力的差異，結(jié)果表明：
　　 Kaubli品種種子蛋白質(zhì)含量與其α-淀粉酶抑制劑抑制活力呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.317，而淀粉含量與α－淀粉酶抑制劑抑制活力呈顯著(P＜0.05)負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.281；Desil品種的相關(guān)性分析表明種子蛋白質(zhì)含量與淀粉酶抑

4、制劑抑制活力之間，以及淀粉含量與淀粉酶抑制劑抑制活力之間無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 鷹嘴豆種子中α－淀粉酶抑制劑抑制活力在不同品種間差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.05)，表明鷹嘴豆種子中α-淀粉酶抑制劑抑制活力在不同品種間存在顯著的基因型差異。Kaubli和Desil品種的α－淀粉酶抑制劑抑制活力變幅分別為7.3～87.9和16.9～118.4U/g，變異系數(shù)分別為47.80％和65.36％。34個(gè)品種α-淀粉酶抑制劑的

5、抑制活力呈偏態(tài)分布，抑制活力在20.0～60.0U/g的品種數(shù)占總品種數(shù)的61.8％。采用系統(tǒng)聚類法，34個(gè)鷹嘴豆品種被聚為4大類群，其品種數(shù)分別為1、7、12、14。
　　 三、對(duì)鷹嘴豆種子蛋白質(zhì)樣α－淀粉酶抑制劑進(jìn)行了分離純化和序列分析，結(jié)果表明：粗提液的硫酸銨分級(jí)沉淀，α－淀粉酶抑制劑主要存在于組分Ⅲ（60～80％）和Ⅳ(80～100％)中；Ⅲ和Ⅳ的合并液用于離子交換色譜，結(jié)果顯示有一個(gè)分離峰具有相對(duì)較高的抑制活性；具有活

6、性的峰收集液用作反相色譜，7個(gè)峰被洗脫下來(lái)，其中峰5具最高的抑制活力(74.1％)；峰5的收集液經(jīng)真空冷凍干燥，得到的粉末再經(jīng)胰蛋白酶水解后，高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS-MS)檢測(cè)得到三個(gè)肽片段，分別為L(zhǎng)HQNIGSSSSPDIYNPQAGR（片段1，殘基數(shù)20）、YQQEGSEEEENEGGNIFSGFK（片段2，殘基數(shù)21）和FYLAGNHEQEFLR（片段3，殘基數(shù)13）。經(jīng)聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行序列比對(duì)，三個(gè)片段的序列與與鷹嘴豆球蛋白Q

7、9SMJ4序列相似性達(dá)到100％，因此我們純化獲得的α－淀粉酶抑制劑可識(shí)別為鷹嘴豆球蛋白，其分子量為25.947kDa，同時(shí)推測(cè)其可能為鷹嘴豆球蛋白(Q9SMJ4)的一個(gè)亞基；進(jìn)一步將其氨基酸序列與其它已知幾類α-淀粉酶抑制劑氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，相似性很低（0～26％），說(shuō)明我們純化獲得的α－淀粉酶抑制劑在氨基酸序列上不同于已知的α－淀粉酶抑制劑類型。
　　 四、根據(jù)部分氨基酸序列以及相似性很高的Q9SMJ4蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引

8、物，克隆出一球蛋白樣α-淀粉酶抑制劑候選基因，其ORF全長(zhǎng)1494bp，編碼497個(gè)氨基酸，與Q9SMJ4蛋白的相似性為88％。
　　 五、對(duì)鷹嘴豆種子子葉和胚分別進(jìn)行α-淀粉酶抑制劑的提取，并對(duì)提取液進(jìn)行了抑制活性檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)真菌（Bαcillus subtilis）來(lái)源的α-淀粉酶，子葉和胚提取液均未檢測(cè)到抑制活性；對(duì)HSA和PPA，胚提取液抑制活力分別為46.9％和4.3％，子葉提取液對(duì)HSA的抑制活力為32.1％，而

9、對(duì)PPA則沒(méi)有檢測(cè)到抑制活力；對(duì)從植物來(lái)源的α-淀粉酶(PA)，子葉提取液未檢測(cè)到抑制活力，而胚提取液則具有較好的抑制活力；而對(duì)細(xì)菌（Aspergillus oryzαe）來(lái)源的α-淀粉酶子葉和胚提取液抑制活性大小相近。
　　 鷹嘴豆種子發(fā)芽1d后，子葉和胚提取液對(duì)細(xì)菌來(lái)源的α-淀粉酶抑制活性迅速降低，發(fā)芽4d后，子葉和胚提取液已經(jīng)檢測(cè)不到抑制活性；發(fā)芽1d后，胚提取液已檢測(cè)不到對(duì)HSA的抑制活性，而在子葉提取液中還有部分抑制活

10、力，發(fā)芽5d后，在子葉中已檢測(cè)不到抑制活性；發(fā)芽1d后，無(wú)論子葉提取液還是胚提取液對(duì)PPA和PA都檢測(cè)不到抑制活力。
　　 開(kāi)花后10d，鷹嘴豆種子子葉提取液和胚提取液開(kāi)始檢測(cè)到對(duì)HSA和細(xì)菌來(lái)源的α－淀粉酶的抑制活性，30d時(shí)達(dá)到最大；對(duì)PA，胚提取液抑制活性在30d時(shí)達(dá)到最大，而在子葉提取液中均未檢測(cè)到抑制活性。
　　 α－淀粉酶抑制劑粗提液對(duì)HSA和PA有抑制活性，分別為46.9％和46.6％；對(duì)真菌、細(xì)菌源α-淀

11、粉酶和PPA有較低或幾乎沒(méi)有抑制活性。而純化后的蛋白質(zhì)樣α-淀粉酶抑制劑對(duì)HSA、PA和PPA都具有較高的抑制活性，分別為73.6％,67.3％和80.3％；對(duì)真菌和細(xì)菌源α－淀粉酶則沒(méi)有檢測(cè)到或有較低的抑制活力。與粗提液相比，純化后的蛋白質(zhì)樣α－淀粉酶抑制劑對(duì)HSA、PA和PPA的抑制活性都有所提高。
　　 六、對(duì)蛋白質(zhì)樣α－淀粉酶抑制劑的部分酶學(xué)特性的研究結(jié)果表明：蛋白質(zhì)樣α-淀粉酶抑制劑對(duì)三種α-淀粉酶（HSA,PPA和P

12、A）的抑制作用的最適溫度在37～40℃之間，最適pH值為6.5時(shí)，對(duì)PPA和PA而言，抑制劑的抑制活性范圍為pH4.0～8.5，而對(duì)HSA而言，其抑制活性范圍為pH4.0～9.5;抑制劑對(duì)三種α-淀粉酶的抑制活性隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中對(duì)HSA和PA的抑制活性在20min時(shí)達(dá)到最大，而對(duì)PPA的抑制活性則在30min時(shí)達(dá)到最大；在底物濃度為1％時(shí)，抑制劑對(duì)HSA和PPA的抑制活力最大，而對(duì)PA的抑制活性，則在1.5％時(shí)最大；抑制

13、劑濃度在0.07～0.32mg/mL的范圍內(nèi)時(shí)，其對(duì)HSA、PPA和PA的抑制活性隨濃度增加而增加；抑制劑對(duì)HSA、PPA和PA最大半抑制濃度分別由線性關(guān)系式y(tǒng)=203.7x+4.744(R2=0.944),y=133.4x+33.04(R2=0.932),y=186.6x-2.881(R2=0.991)，求得ID5o=8.56×106mol/L,4.89×106mol/L和1.09×10-5 mol/L;抑制劑與α－淀粉酶的結(jié)合和底物

14、之間呈混合型非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)Ki分別1.668×10-5mol/L，1.864×10-5mol/L和3.037×10-5mol/L;Ksi分別為1.427×10-5mol/L,1.558×10-5mol/L和1.410×10-5rnol/L。
　　 七、考察了從提取到硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換色譜和反相液相色譜三步純化步驟獲得的α－淀粉酶抑制劑的生物活性。結(jié)果表明：α－淀粉酶抑制劑具有一定的清除自由基和還原能力；在一定的反應(yīng)