天藍(lán)黃鏈霉菌及其產(chǎn)生的新型α-淀粉酶抑制劑研究.pdf

1、口服α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑能直接延緩腸道中淀粉的消化和吸收,進(jìn)而有效降低餐后高血糖,因此已成為最便捷安全有效的一線降糖藥物之一。目前市售α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑主要是阿卡波糖的各類制品,其專利為國外機(jī)構(gòu)所有。而目前國內(nèi)的α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑制品也多是阿卡波糖的仿制品,競爭力較低。因此開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的,生物活性更強(qiáng)的新型α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑具有非常廣闊的應(yīng)用前景。 本研究從糖的消化、吸收、代謝途徑入手,建立了α-淀

2、粉酶/糖苷酶抑制藥物的高通量篩選模型,并利用該模型對1000余株土壤放線菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了廣泛篩選,獲得了數(shù)株能夠產(chǎn)生α-淀粉酶/糖苷酶抑制劑的菌株。經(jīng)復(fù)篩確認(rèn)后,最終選擇了一株鏈霉菌,即菌株ZG0656作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。 本研究首先對菌株ZG0656生物學(xué)分類地位的歸屬進(jìn)行研究。根據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、細(xì)胞壁化學(xué)組成特征和16S rDNA全序列相似性比較分析等多相分類方法,確認(rèn)菌株ZG0656為天藍(lán)黃鏈霉菌

3、的新變種,命名為天藍(lán)黃鏈霉菌南開變種(Streptomyces coelicoflavus var.nankaiensis)。該菌株的特征性菌核樣特化結(jié)構(gòu)在鏈霉菌屬中比較罕見。 其次,本研究在10L發(fā)酵罐水平對菌株ZG0656進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果表明,發(fā)酵液中可積累一定量的α-淀粉酶抑制劑,發(fā)酵產(chǎn)物屬于典型的次級代謝類型。采用濃縮,樹脂吸附,凝膠過濾,減壓干燥等方法得到了α-淀粉酶抑制劑混合物AIB656。經(jīng)初步分析,確認(rèn)AIB6

4、56為含氮的擬低聚糖類物質(zhì),能強(qiáng)烈抑制哺乳動(dòng)物來源的α-淀粉酶,對餐后高血糖的形成有明顯改善作用。 利用半制備型高效液相色譜(HPLC)從α-淀粉酶抑制劑混合物AIB656中分離得到6個(gè)化學(xué)單體。采用酸水解、質(zhì)譜分析(MS)和核磁共振光譜分析(NMR)等技術(shù),對它們進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定,并命名如下：阿卡他定Ⅰ03(1):m=0,n=1,q=2 阿卡他定Ⅱ03(2):m=0,n=2,q=2 *阿卡他定Ⅲ03(3):m=0,n=3,q

5、=2 *木阿卡他定Ⅳ03(4):m=0,n=4,q=2 *阿卡他定Ⅱ23(5):m=2,n=2,q=2 *阿卡他定Ⅱ13(6):m=1,n=2,q=2。 (*為新化合物)采用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Dixon曲線作圖法,證實(shí)每一個(gè)阿卡他定單體均是α-淀粉酶的混合型非競爭性抑制劑。通過對抑制常數(shù)的比較,發(fā)現(xiàn)含有9～12個(gè)糖環(huán)的阿卡他定分子相對抑制強(qiáng)度最高。其中阿卡他定Ⅲ03是迄今發(fā)現(xiàn)的綜合抑制效果最強(qiáng)的α-淀粉酶抑制劑,其相對抑制強(qiáng)度為阿卡波糖的2

6、60倍。在離體水平和體內(nèi)水平的實(shí)驗(yàn)中,阿卡他定Ⅲ03在同劑量的條件下,表現(xiàn)出和阿卡波糖相同的抑制餐后血糖升高的能力,故可將其應(yīng)用于α-淀粉酶抑制劑類新型藥物的開發(fā)。最后,本研究以上述六個(gè)已知阿卡他定作為對照品,通過分析它們的色譜行為和質(zhì)譜裂解規(guī)律,建立了一個(gè)快速、靈敏、簡便的超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC/ESI-MS/MS)分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)可用于分離和鑒別其它未知阿卡他定家族化合物。利用該分析系統(tǒng),對菌株ZG0656的阿卡他

7、定家族次級代謝物組進(jìn)行了輪廓描述。共描述了80個(gè)阿卡他定家族化合物的輪廓,包括15個(gè)已知化合物和65個(gè)新化合物。在這些首次報(bào)道的化合物中,包括一些比較新穎和獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型,如含有5個(gè)假三糖核心單位的結(jié)構(gòu)類型,直接以脫氧葡萄糖在還原端結(jié)尾的結(jié)構(gòu)類型,非還原端缺少一個(gè)環(huán)醇?xì)埢慕Y(jié)構(gòu)類型,等等。 本研究利用高通量篩選模型篩選得到了一株產(chǎn)生α-淀粉酶抑制劑的天然菌株ZG0656。將其作為出發(fā)菌株,系統(tǒng)研究了其分類地位,發(fā)酵培養(yǎng),產(chǎn)物