虎杖與夏枯草中胰脂肪酶抑制劑的親和篩選.pdf

1、肥胖嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康，直接或間接地導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生。為治療肥胖，各種減肥藥物和替代療法正在不斷研發(fā)之中，其中，胰脂肪酶(Pancreatic Lipase，PL)抑制劑減肥藥物研究成為熱點(diǎn)之一，奧利司他(Orlistat)即為其突出代表，但其仍存在許多毒副作用。為此，研發(fā)一種高效、低毒、可長(zhǎng)期服用的抑制胰脂肪酶減肥藥物成為目前主要任務(wù)。鑒于天然植物成分具有結(jié)構(gòu)多樣、來(lái)源廣、毒副作用相對(duì)較小，從中篩選安全、有效的PL抑制劑成為主要研

2、究目標(biāo)，同時(shí)，鑒于傳統(tǒng)藥物篩選存在耗時(shí)長(zhǎng)、目標(biāo)性差、分離過(guò)程繁雜等不足，選擇一種高效、目標(biāo)性強(qiáng)、分離簡(jiǎn)單的手段是必不可少的。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期選用磁珠固定化酶篩選天然產(chǎn)物PL抑制劑，取得了良好結(jié)果，但其固定化酶合成條件并未進(jìn)行優(yōu)化。本論文在此基礎(chǔ)上，首先優(yōu)化了磁珠固定化PL合成條件，并進(jìn)行了驗(yàn)證。其次通過(guò)調(diào)研大量文獻(xiàn)，選取了8種粗提物具有較好抑制PL活性的天然植物，制備了它們的粗提物和相應(yīng)亞組分，并對(duì)其抑酶活性進(jìn)行了測(cè)定。然后，選

3、擇抑酶活性較好的虎杖、夏枯草亞組分，對(duì)其進(jìn)行了固定化酶篩選，并測(cè)定了篩選出的抑制劑抑酶活性和抑制類(lèi)型。最后，通過(guò)聯(lián)合指數(shù)法(Chou-Talalay)分析了不同PL抑制劑之間的協(xié)同拮抗作用，為配制有效成分組合中藥和了解抑制劑作用機(jī)制打下一定的基礎(chǔ)。主要內(nèi)容與研究結(jié)果如下:
　　1.固定化酶合成條件優(yōu)化及模型驗(yàn)證。首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析建立了合成固定化酶多元二次回歸方程模型，優(yōu)化了合成固定化酶反應(yīng)條件，然后對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行電鏡及

4、紅外表征，最后利用橙皮苷（陽(yáng)性抑制劑）及五味子醇甲（陰性抑制劑）對(duì)優(yōu)化的固定化酶進(jìn)行穩(wěn)定性、專一性及重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:緩沖液pH值7.48、PL濃度20.32mg/mL、溫度35.40℃為最佳合成條件，PL成功固定于磁珠之上，且儲(chǔ)存2周后固定化酶的活力仍保持80％以上，可特異性篩選出陽(yáng)性抑制劑，重復(fù)利用五次后酶活仍保持50％以上。本實(shí)驗(yàn)成功為下述固定化酶篩選抑制劑實(shí)驗(yàn)奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　2.幾種天然植物的提取分離及對(duì)酶

5、抑制作用的測(cè)定。首先測(cè)定了8種天然植物粗提物抑制PL的作用，然后選取抑酶活性較好的4種植物，進(jìn)一步分離，最后分別測(cè)定各個(gè)組分對(duì)PL的抑制作用。結(jié)果表明:8種天然植物中，虎杖80％乙醇分離部位及夏枯草40％乙醇分離部位抑酶活性最高，IC50值分別為90μg/mL、80μg/mL，可作為下述固定化酶篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　3.虎杖與夏枯草最高抑酶活性組分中抑制劑的篩選。利用固定化酶分別對(duì)虎杖與夏枯草兩種植物的最高抑酶活性組分進(jìn)行胰脂肪酶抑

6、制劑的篩選，并對(duì)篩選出的抑制劑進(jìn)行了抑酶活性和抑制類(lèi)型的測(cè)定。結(jié)果表明:分別從兩種植物組分中篩選出了4個(gè)PL抑制劑，它們包含1個(gè)萜類(lèi)（熊果酸），2個(gè)酚類(lèi)（咖啡酸、白藜蘆醇），2個(gè)黃酮類(lèi)（蘆丁、橙皮苷），3個(gè)蒽醌類(lèi)（大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖、大黃素甲醚），其中橙皮苷的抑酶效果最好（IC50=31.5±4.4μg/mL）。
　　4.PL抑制劑之間協(xié)同效應(yīng)研究。選取9種不同類(lèi)型抑制劑，包括非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(Noncompeti