傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸中糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和屎腸球菌(Enterococcus faecium)產(chǎn)生物胺交互作用研究.pdf

1、生物胺是食品中普遍存在的一種由微生物代謝產(chǎn)生的堿性有害物質(zhì)，在肉和肉制品、魚類產(chǎn)品、乳及乳制品、蔬菜水果以及調(diào)味料中都常被檢出，尤其是在發(fā)酵食品中，其含量更高。大量的生物胺被人體攝入就會(huì)引起惡心，腹瀉、嘔吐、頭痛、腹部痙攣、血壓升高等毒副作用，是一種潛在的食品安全威脅。糞腸球菌和屎腸球菌是兩種被廣泛報(bào)道的生物胺產(chǎn)生菌，它們能夠產(chǎn)生大量的酪胺和苯乙胺。目前關(guān)于單獨(dú)的糞腸球菌或屎腸球菌在各種溫度、pH、供氧量、添加劑等條件下的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)生

2、物胺能力的研究已有少量報(bào)道，但是關(guān)于這兩種菌共同存在時(shí)的生長(zhǎng)和產(chǎn)生物胺能力的研究卻未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究成果顯示糞腸球菌和屎腸球菌常在傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸中被同時(shí)檢出，且它們都是傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸中的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生物胺菌并可能存在交互作用，因此，本試驗(yàn)以前期分離得到的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生物胺糞腸球菌和屎腸球菌為材料，分別在純菌培養(yǎng)條件下和模擬傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸生產(chǎn)工藝條件下，研究以不同比例混合的糞腸球菌和屎腸球菌以及糞腸球菌和屎腸球菌純菌的生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)生物

3、胺狀況，揭示糞腸球菌和屎腸球菌產(chǎn)生物胺的交互作用。具體研究結(jié)果如下：
　　 1、糞腸球菌和屎腸球菌PCR檢測(cè)方法建立
　　 本研究將糞腸球菌和屎腸球菌的酪氨酸脫羧酶基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的其它細(xì)菌的酪氨酸脫羧酶基因進(jìn)行比對(duì)，分別在糞腸球菌和屎腸球菌酪氨酸脫羧酶基因的非保守序列設(shè)計(jì)其各自的特異性引物，通過對(duì)這些引物的特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、靈敏性等特性進(jìn)行分析比較，最終從設(shè)計(jì)的多對(duì)引物中分別選出了一對(duì)糞腸球菌和

4、屎腸球菌各自的特異性引物，利用這兩對(duì)特異性引物可以方便、快捷地完成產(chǎn)生物胺糞腸球菌和屎腸球菌的定性檢測(cè)，方法的檢測(cè)限可達(dá)到1.0×102cfu/mL。對(duì)本研究設(shè)計(jì)的糞腸球菌和屎腸球菌特異性引物，以及文獻(xiàn)報(bào)道中常用的幾對(duì)糞腸球菌和屎腸球菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增曲線和熔解曲線比較，發(fā)現(xiàn)C.M.Sedgley等設(shè)計(jì)的以細(xì)菌16S rDNA可變區(qū)為目的序列的引物可用于糞腸球菌的定量檢測(cè)，而其它引物只適用于在普通PCR中對(duì)糞腸球菌和屎腸球菌進(jìn)行定性檢

5、測(cè)。
　　 2、純菌培養(yǎng)體系中糞腸球菌和屎腸球菌產(chǎn)生物胺交互作用研究
　　 將制備好的濃度均為102cfu/mL的糞腸球菌和屎腸球菌菌懸液按照不同比例分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃兼性厭氧條件下培養(yǎng)，每4h取一次樣，對(duì)體系pH值、細(xì)菌數(shù)量、酪胺和苯乙胺生成量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，連續(xù)監(jiān)測(cè)48h。結(jié)果顯示：糞腸球菌和屎腸球菌之間存在顯著的交互作用。當(dāng)糞腸球菌和屎腸球菌以1:9比例混合接種培養(yǎng)時(shí)，體系中的pH值、細(xì)菌生長(zhǎng)速率、酪胺產(chǎn)

6、量均顯著低于其它各組，即在這種比例下，糞腸球菌和屎腸球菌產(chǎn)生了拮抗作用，使得體系中細(xì)菌的生長(zhǎng)能力受到抑制，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，但這種抑制作用并不是一直都存在的，最終這一處理組的細(xì)菌總數(shù)與其它各組并無(wú)顯著差異，體系中酪胺的產(chǎn)生也受到抑制，生成量顯著少于其它各處理組。當(dāng)糞腸球菌和屎腸球菌以9:1比例混合接種培養(yǎng)時(shí)，體系中細(xì)菌數(shù)量顯著高于其它各組，即這種條件下糞腸球菌和屎腸球菌產(chǎn)生了協(xié)同作用，但是這種協(xié)同作用只是促進(jìn)了細(xì)菌在某一時(shí)期的生長(zhǎng)，而對(duì)生物

7、胺的產(chǎn)生并沒有影響。當(dāng)糞腸球菌與屎腸球菌混合接種培養(yǎng)以及屎腸球菌單獨(dú)接種培養(yǎng)時(shí)，各處理組間的苯乙胺生成量并無(wú)顯著差別，而當(dāng)糞腸球菌單獨(dú)接種培養(yǎng)時(shí)體系中苯乙胺的生成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它各處理組，說明糞腸球菌的產(chǎn)苯乙胺能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于屎腸球菌，而當(dāng)兩者混合培養(yǎng)時(shí)，糞腸球菌的這種能力被強(qiáng)烈抑制，兩者間的拮抗作用使得體系中苯乙胺的產(chǎn)量大大降低。
　　 3、傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸體系中糞腸球菌和屎腸球菌產(chǎn)生物胺交互作用研究
　　 以各種不同比例混

8、合的糞腸球菌和屎腸球菌作為發(fā)酵劑，在模擬條件下進(jìn)行傳統(tǒng)中式香腸的發(fā)酵和成熟，并分別在發(fā)酵過程中的第0、2、4、7、14和28天取樣，進(jìn)行試驗(yàn)分析。結(jié)果顯示：糞腸球菌和屎腸球菌在傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸體系中也存在交互作用，但是這種交互作用卻沒有純菌培養(yǎng)條件下明顯，這與傳統(tǒng)中式發(fā)酵香腸復(fù)雜的基質(zhì)以及少量的外源菌污染有關(guān)。當(dāng)糞腸球菌和屎腸球菌以1:9比例混合接種發(fā)酵時(shí)，樣品中糞腸球菌數(shù)量顯著少于其它各組而細(xì)菌總數(shù)卻與其它各組無(wú)顯著差別，說明當(dāng)糞腸球