黃花棘豆抗逆轉錄因子OoNAC72的克隆及功能初步分析.pdf

1、黃花棘豆作為中國西部草原地區(qū)的主要毒害草之一，給畜牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境造成巨大損失和破壞。黃花棘豆優(yōu)勢分布區(qū)多為干旱少雨且寒冷的地區(qū)，其迅速蔓延與自身極強的抗逆性密切相關。因此，對其抗逆機理研究成為解析黃花棘豆蔓延機制的重要突破點。但目前研究主要集中在分布情況的調查統(tǒng)計、化感作用和毒理研究等方面，尚未觸及抗逆機理研究。研究表明逆境脅迫下轉錄因子參與的轉錄調控對植物生長至關重要，而NAC轉錄因子又是植物特有的廣泛參與各種逆境脅迫的重要轉錄因子。

2、因此，本研究以NAC轉錄因子為切入點，充分利用已經獲得的黃花棘豆轉錄組差異基因的數(shù)據，篩選出響應逆境脅迫關鍵NAC轉錄因子，并對其進行生物信息學分析、生物學特征分析、表達譜分析和功能驗證等方面的研究，以明確其調控方式與途徑，進而從轉錄調控層面來探究黃花棘豆的分子抗逆機制，以期為解析其蔓延的內在機制提供新的依據。
　　(1)根據黃花棘豆轉錄組測序數(shù)據分析及相關文獻報道，確定注釋為NAC轉錄因子的Unigene comp71824為研

3、究目標。隨后利用primer5軟件設計特異引物，從黃花棘豆幼苗中成功克隆到該基因，命名為OoNAC72。OoNAC72基因序列全長1376bp，ORF為996bp，密碼子起始位點在49bp位置，密碼子終止位點在1045bp位置，編碼331個氨基酸。利用NCBI的BlastX分析，結果顯示黃花棘豆OoNAC72的N端含有一個長122(98～220)個氨基酸的NAM結構域，屬于典型NAC轉錄因子。
　　(2)對克隆得到的黃花棘豆OoN

4、AC72基因序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)黃花棘豆OoNAC72蛋白不具有跨膜結構域，不存在信號肽，強親水性極強，推測其定位在細胞核內。OoNAC72蛋白含有7個糖基化位點和19個磷酸化位點。和已知NAC家族蛋白比對發(fā)現(xiàn)該蛋白在NAM結構域高度保守，而NAM結構域以外的部分具有較高多態(tài)性，同時NAM結構域可以被分為A～E五個亞區(qū)域，進化樹顯示該蛋白與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆相似度最高，親緣關系最近。
　　(3)構建了pCAMBI1302-O

5、oNAC72-eGFP植物融合表達載體，利用農桿菌介導煙草瞬時轉化法進行對OoNAC72進行亞細胞定位分析，結果顯示OoNAC72分布于煙草表皮細胞的細胞核中。同時，構建pGBKT7-OoNAC72酵母重組載體，通過酵母單雜交實驗對OoNAC72轉錄因子進行轉錄激活活性分析，結果表明OoNAC72具有轉錄激活活性。整個生物學特征分析表明OoNAC72符合轉錄因子的基本特征。
　　(4)運用qRT-PCR方法對黃花棘豆OoNAC72

6、基因在干旱、高鹽、低溫脅迫處理與脫落酸、乙烯、赤霉素三種激素處理下的表達譜進行分析，結果顯示:干旱、高鹽、低溫非生物脅迫均可顯著誘導OoNAC72基因的表達;激素處理下受脫落酸高效誘導表達，而乙烯和赤霉素處理對OoNAC72基因的表達影響不顯著。結果表明，OoNAC72基因可能通過依賴ABA的信號途徑參與黃花棘豆對逆境脅迫的應答反應。
　　(5)通過農桿菌介導的蘸花法遺傳轉化擬南芥(Col-0)，T1代轉基因植株經潮霉素培養(yǎng)基的篩