復合生長因子和基因制備促血管再生活性支架的研究.pdf

1、隨著再生醫(yī)學/組織工程的發(fā)展,人們對支架材料的要求也不再局限于生物相容性,而要求支架具有生物活性,能夠促進細胞增殖、分化,從而引導組織再生. 本文首先嘗試了用生長因子構建活性支架.采用層層自組裝技術,在TCPS表面成功地構建了(aFGF/heparin)/PEI自組裝多層膜.體外成纖維細胞培養(yǎng)的結果證明,aFGF 在多層膜中仍然保持一定的生物活性,可促進成纖維細胞增殖并促進I型膠原和白介素6的分泌.體外PBS浸泡實驗顯示(aFGF

2、/heparin)/PEI多層膜具有一定的穩(wěn)定性,但浸泡48h后,多層膜的生物活性顯著下降,而保存在-20℃可以有效地保持多層膜的生物活性.將層層自組裝技術成功地應用于膠原多孔支架的改性,構建了具有生物活性的膠原支架.成纖維細胞在該支架中的MTT活性有所提高,但不顯著. 針對生長因子活性不易保持、難以控釋、價格昂貴等缺點,我們進行了將表達生長因子的基因及其載體與組織工程支架相結合,從而構建活性支架的探索.我們制備了N-三甲基殼聚糖

3、(TMC)和N-三甲基殼寡糖(TMO),可通過反應時間控制其季銨化程度.TMC/TMO可與DNA通過靜電作用形成幾百納米大小的微粒,其尺寸受N/P值調控.較高的季銨化程度可以獲得較小的復合物微粒.載體與DNA的結合能力隨著季銨化程度的增加而增大,形成復合物的表面電勢亦隨之增大.載體的毒性隨季銨化程度和分子量的增加而增大.細胞對復合物微粒的吞噬量隨著 TMC的季銨化程度增加而增加,但載體的基因轉染能力隨季銨化程度增加而先增加后降低,其轉染

4、能力優(yōu)于PEI,但仍低于Lipofectamine2000. 制備了聚N-異丙基丙烯酰胺和TMC的接枝共聚物(TMC-g-PNIPAAm),其LCST 為32℃.TMC-g-PNIAAm共聚物的LCST隨鹽溶液濃度的增大而減小,但不受pH值影響.TMC-g-PNIPAAm/DNA微粒的大小在200～900nm之間,溫度對微粒粒徑的影響不顯著.微粒的表面電勢和TMC-g-PNIPAAm與DNA的結合力受溫度調控.接枝 PNIPAAm

5、 對37℃下的細胞吞噬行為沒有明顯影響.TMC-g-PNIPAAm/DNA微粒的基因轉染效率受溫度調控,降低溫度可以顯著提高TMC-g-PNIPAAm的基因轉染效率.其最佳轉染效率與Lipofectamine2000.相當,而細胞毒性則顯著低于Lipofectamine2000.以二氧化硅微粒為模型,在其表面接枝Tat多肽.Tat接枝量可由投料量控制,并且接枝Tat對微粒的物理性質無顯著影響.發(fā)現Tat多肽可介導細胞對微粒的吞噬,同時還

6、會改變胞吞后微粒在細胞內的分布,可將微粒導入細胞核區(qū).使用戊二醛可以有效地將Tat多肽接枝到TMO/DNA微粒上,通過反應條件可控制Tat接枝量.接枝Tat多肽對TMO/DNA微粒的物理性質和細胞毒性無顯著影響,但可顯著提高細胞吞噬量和基因轉染效率. 以表達VEGF的質粒DNA為模型,將載體/DNA微粒通過物理吸附的方法復合到膠原支架中,結合量受微粒濃度調控.載體/DNA微粒在支架中有一定的緩釋能力.將負載載體/DNA微粒的膠原支