單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的純化及有關物質(zhì)測定方法研究.pdf

1、臨床研究表明，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）有利于促進創(chuàng)傷性和血管性腦損傷的恢復，并對神經(jīng)細胞有保護作用，是目前臨床上治療腦血管意外創(chuàng)傷、腦脊髓損傷和帕金森病的一線藥物。GM1提取和純化的工藝較為復雜，其原料藥處于供不應求的狀態(tài)；另外其純化過程中極易殘留高分子物質(zhì)以及其他神經(jīng)節(jié)苷脂類雜質(zhì)。因此，建立一個簡單、高效的提取純化方法，獲得高質(zhì)量的GM1，探索出高靈敏度、高分辨率的檢測方法對產(chǎn)品質(zhì)量進行控制，具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。<

2、br>　　本課題建立并優(yōu)化了陰離子（Q SepharoseTM Fast Flow）交換層析制備GM1的方法，并應用三批小規(guī)模的中試對所優(yōu)化的方法進行了驗證；對陰離子交換層析法制備的樣品參照現(xiàn)有標準進行了化學和物理層面的鑒別和對比研究；同時進行了初步的安全性探討；最后，新建了GM1的有關物質(zhì)測定方法，為GM1的質(zhì)量控制和有關物質(zhì)深入研究提供了方法的可行性。
　　研究結果如下：
　?、俳?jīng)過吸附填料、洗脫用鹽和流動相的篩選以及純

3、化工藝參數(shù)的優(yōu)化四方面的試驗工作，選擇Q SepharoseTM Fast Flow為層析用填料、含4 mM醋酸鉀的氯仿-甲醇（15：85，v:v）溶液為洗脫流動相時，陰離子交換層析法可以達到最佳的純化效果。
　?、谥性囼炞C結果顯示，100 kg豬腦用Svennerholm提取法提取得到總GLs，之后經(jīng)所優(yōu)化的陰離子交換層析法純化后得到GM1純品約70 g，純化總耗時約為36 h。對比目前的生產(chǎn)工藝，該方法既保證了GM1收率，又大

4、大縮短了純化的周期，而且方法的重復性和穩(wěn)定性較好，有放大生產(chǎn)的可行性。
　?、蹖⒅性嚨玫降腉M1成品與對照品進行多方面對比研究，包括顏色鑒別反應、色譜分析和光譜分析，結果顯示所得到的的樣品理化性質(zhì)與對照品完全相同，證明了所得樣品與對照品組成成分相同。
　?、軕肎M1的國家法定標準檢測三批中試成品的有關物質(zhì)和含量測定項，結果顯示三批次成品的雜質(zhì)限度全部合格，遠遠低于標準的限量。三批次的含量均高于98％，遠遠高于現(xiàn)有標準，而且

5、三批次樣品的檢測結果呈現(xiàn)一致性，說明本研究所建立的陰離子交換層析純化方法穩(wěn)定性好。
　?、萆锇踩Y果顯示，產(chǎn)品異常毒性合格；蛋白質(zhì)含量測定結果在0.11%~0.13%之間，小于現(xiàn)有標準規(guī)定（0.5%）；重金屬檢測結果顯示，符合藥典的要求，證明此純化工藝無明顯的安全性隱患。
　　⑥應用C8反相色譜柱法建立GM1的有關物質(zhì)測定方法，并進行方法驗證研究，結果顯示所建立方法專屬性、重復性和準確度好，并有較好的線性關系，相關系數(shù)均能

6、達到0.9999，表明該方法可用于GM1有關物質(zhì)的檢測。
　?、邞盟⒌姆聪嗌V柱法測定三批中試成品的有關物質(zhì)，結果顯示，三批次樣品中總雜質(zhì)含量約為7.5%~7.9%，高于國家法定標準總雜質(zhì)的限度（5%），雜質(zhì)檢出數(shù)目約為11個。本方法雜質(zhì)檢出數(shù)和檢出量均高于現(xiàn)有標準，可用于GM1的質(zhì)量控制和有關物質(zhì)深入研究。
　　本研究所優(yōu)化的陰離子交換層析法提高了GM1純化的收率，縮短了純化的周期，具有重要的醫(yī)學和經(jīng)濟價值；所建立的