谷氨酸通過活化脊髓星形膠質細胞參與痛覺敏感的作用觀察.pdf

1、疼痛尤其是病理痛包括慢性疼痛和痛覺敏感是嚴重的公共健康問題，疼痛的產生是由于各種類型的組織損傷，包括物理創(chuàng)傷、炎癥和自身免疫疾病等，常表現(xiàn)為包括損傷部位在內的廣泛區(qū)域的疼痛、感覺異常和痛覺敏感（包括熱痛覺敏感和機械性痛覺敏感）。慢性疼痛在不存在明確傷害性刺激的情況下可能也會持續(xù)數(shù)月，嚴重影響個人生活質量。經典的觀點認為，疼痛信號首先被外周的感覺器感受并傳遞至脊髓后角感覺神經元，通過不同的途徑，最后傳遞到相應的感覺皮層。研究發(fā)現(xiàn)痛覺傳導系

2、統(tǒng)神經元的功能改變與疼痛的異常改變如慢性疼痛等密切相關，其機制包括神經元的異位放電、神經化學物質包括神經遞質、炎性介質及細胞因子的過量釋放和突觸的長時程增強等。有研究表明慢性疼痛可能是周圍致敏（初級傳入神經元的敏感性增加）和中樞致敏（中樞神經系統(tǒng)的感覺神經元的過度興奮）等因素共同作用的結果。然而，以往大量的研究主要是基于對神經元的研究，如神經元可塑性、神經遞質和神經通路等。雖然長期的研究已積累了大量的資料，但疼痛機制仍未明了，而且依據神

3、經元痛覺學說設計的鎮(zhèn)痛措施并不理想。從上世紀九十年代早期，研究者開始關注神經系統(tǒng)的另一種細胞即神經膠質細胞，并且發(fā)現(xiàn)膠質細胞在慢性疼痛的病理過程中也發(fā)揮著至關重要的作用。
　　 雖然神經膠質細胞的數(shù)量比神經元的數(shù)量多得多，但在神經科學研究的漫長歷程中，膠質細胞一直被認為在神經系統(tǒng)只發(fā)揮輔助作用，在神經功能活動中如信息的感受、傳輸、處理過程不發(fā)揮作用。如星形膠質細胞被認為僅僅具有支持、保護和營養(yǎng)神經元的作用。而近期的研究證實，神經

4、膠質細胞通過與神經元相互作用參與各種神經功能活動的調控。在各種疼痛模型中包括外周或中樞的神經損傷或炎性痛，動物除表現(xiàn)慢性疼痛的癥狀（如熱痛覺敏感和機械性觸誘發(fā)痛）外，還出現(xiàn)了脊髓膠質細胞的活化。在神經組織損傷或發(fā)生炎癥后，星形膠質細胞可以從靜息態(tài)轉化為激活態(tài)，活化的星形膠質細胞除表現(xiàn)出形態(tài)改變外，還合成和釋放大量神經活性物質，包括神經遞質（興奮性氨基酸、ATP、NO等）和細胞因子（NO、IL-1β、IL-6和TNF-α）等，由此參與痛信

5、號的傳遞與調制。雖然二十年的研究明確證實了膠質細胞在疼痛信號傳遞、感受、調制的重要作用，但由于神經系統(tǒng)是神經元與膠質細胞形成一個混合的網絡體系，因此現(xiàn)有的各實驗體系無法對膠質細胞在疼痛產生過程激活和作用機制進行詳盡研究，如各種刺激如何激活膠質細胞包括星形膠質細胞和小膠質細胞，何種刺激通過哪種受體，作用如何；膠質細胞如何與神經元相互作用參與疼痛信號處理，如通過產生何種物質（如細胞因子或神經遞質）如何作用于神經元以及作用強度、過程均無確切機

6、制。事實上神經膠質細胞與神經元的相互作用由于上述原因（神經元與膠質細胞組成一個混合的網絡體系）一直未有明確的結論，影響了對膠質細胞在各種功能活動調控（包括參與疼痛信號的感受、傳遞、整合）中的作用的深入理解。谷氨酸作為中樞神經系統(tǒng)最重要的興奮性神經遞質，通過不同種類的受體（包括離子型和代謝型受體）在神經生理及病理過程發(fā)揮重要作用。雖然已經有證據顯示，谷氨酸通過不同的受體在外周及脊髓痛信號感受、傳遞、調制過程發(fā)揮重要作用，但這種作用是基于對

7、神經元、膠質組成的混合網絡體系的作用觀察，而它對膠質細胞的作用如對星形膠質細胞的作用，如是否會直接刺激活化星形膠質細胞，是否會通過刺激星形膠質細胞釋放炎性因子（白介素等）參與疼痛信號處理等尚無報道。
　　 目的：
　　 1.通過離體培養(yǎng)脊髓星形膠質細胞觀察谷氨酸對星形膠質細胞的活化作用，包括形態(tài)學觀察及IL-6的檢測；
　　 2.利用痛行為檢測方法觀察經谷氨酸刺激活化的脊髓星形膠質細胞對動物痛行為的影響。

8、　　 方法：
　　 1．原代培養(yǎng)雄性Wistar大鼠（出生后1-2天）的脊髓星形膠質細胞。細胞培養(yǎng)9-14天后，將細胞分為14組：(1)空白對照組，細胞孵育全培液；(2)ATP組（陽性對照），全培液+50μM ATP 孵育1小時；(3)全培液+谷氨酸500μM 1h、6 h、12 h和24 h組；(4) 全培液+谷氨酸1000μM 1h、6 h、12 h和24 h組；(5) 全培液+谷氨酸2000μM 1h、6 h、12 h和

9、24 h組。
　　 2．用免疫細胞化學方法鑒定GFAP 陽性的星形膠質細胞，并觀察細胞活化后形態(tài)的變化。
　　 3．用ELISA 試劑盒檢測大鼠脊髓星形膠質細胞中IL-6蛋白水平（反映星形膠質細胞活化的指標）的表達水平，從而觀察谷氨酸活化脊髓星形膠質細胞激活的相應濃度和時間過程。
　　 4．用Real-Time PCR 法檢測大鼠星形膠質細胞中IL-6 轉錄水平的表達水平，從mRNA水平觀察谷氨酸活化脊髓星形膠質

10、細胞的情況。
　　 5．將在體外被激活的脊髓星形細胞通過鞘內插管注射到成年Wistar 雄性大鼠（約200g）的脊髓腰膨大部位，分別在細胞注射前和注射后2 h、4 h和6 h 檢測大鼠的熱痛覺敏感反應（PWL），觀察活化的脊髓星形膠質細胞在熱痛覺敏感中的作用。
　　 結果：
　　 1．采用GFAP免疫細胞化學的方法鑒定出培養(yǎng)的細胞是星形膠質細胞。
　　 2．以全培液組為空白對照組，ATP組為陽性對照組，谷

11、氨酸500μm24 h組細胞部分發(fā)生形態(tài)變化，胞體變圓、突起收縮；而谷氨酸1000μM和2000μM組，細胞形態(tài)從6 h 即開始改變，逐漸到24 h 谷氨酸對細胞的作用強度達到最大（該時間為本實驗研究的最后一個時間點）。
　　 3．IL-6蛋白檢測結果顯示，谷氨酸500μM在4個時間點的IL-6水平與空白對照組(10.81±2.87)相比，均無統(tǒng)計學差異。而谷氨酸1000μM和谷氨酸2000μM組，IL-6 含量從6小時開始明顯

12、增加(分別為153.30±2.08和69.41±18.14)，并隨時間逐漸上升。但谷氨酸2000μM組IL-6 比1000μM組相比較低。IL-6 含量在谷氨酸1000μm24 h組(426.53±33.89)達到最高(p<0.05)。
　　 4．IL-6 mRNA 檢測結果顯示，與空白對照組(1.05±0.17)相比，IL-6 轉錄水平在谷氨酸500μM作用于細胞24 h（17.77±2.32，P<0.05）大大增加；在谷氨酸

13、1000μM和2000μM組作用細胞6 h，IL-6 開始轉錄增加（分別為4.52±0.96和3.47±0.30，P<0.05）；谷氨酸濃度為500μM、1000μM和2000μM作用于細胞24 h（本實驗研究的最后一個時間點），IL-6 轉錄水平明顯增加(分別為17.77±2.32、22.43±1.42和24.12±3.14，P<0.05)，且呈濃度依賴性上升趨勢。
　　 5．上述實驗結果提示，谷氨酸激活脊髓星形膠質細胞的有效

14、濃度為1000μM和2000μM，有效時間點為6 h、12 h和24 h。
　　 6．將谷氨酸刺激活化的星形膠質細胞注射入成年大鼠脊髓蛛網膜下腔內，發(fā)現(xiàn)在注射后2小時，大鼠的PWL 開始明顯降低(P<0.05)，并且在注射后4 h和6 h 隨時間逐漸降低（P<0.05）。
　　 結論：
　　1．谷氨酸可以直接活化脊髓星形膠質細胞，其有效濃度為1000μM，時間需持續(xù)6 h以上。
　　2．通過谷氨酸激活的脊