谷氨酸通過活化脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞參與痛覺敏感的作用觀察.pdf

1、疼痛尤其是病理痛包括慢性疼痛和痛覺敏感是嚴(yán)重的公共健康問題，疼痛的產(chǎn)生是由于各種類型的組織損傷，包括物理創(chuàng)傷、炎癥和自身免疫疾病等，常表現(xiàn)為包括損傷部位在內(nèi)的廣泛區(qū)域的疼痛、感覺異常和痛覺敏感（包括熱痛覺敏感和機(jī)械性痛覺敏感）。慢性疼痛在不存在明確傷害性刺激的情況下可能也會持續(xù)數(shù)月，嚴(yán)重影響個人生活質(zhì)量。經(jīng)典的觀點(diǎn)認(rèn)為，疼痛信號首先被外周的感覺器感受并傳遞至脊髓后角感覺神經(jīng)元，通過不同的途徑，最后傳遞到相應(yīng)的感覺皮層。研究發(fā)現(xiàn)痛覺傳導(dǎo)系

2、統(tǒng)神經(jīng)元的功能改變與疼痛的異常改變?nèi)缏蕴弁吹让芮邢嚓P(guān)，其機(jī)制包括神經(jīng)元的異位放電、神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)包括神經(jīng)遞質(zhì)、炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的過量釋放和突觸的長時程增強(qiáng)等。有研究表明慢性疼痛可能是周圍致敏（初級傳入神經(jīng)元的敏感性增加）和中樞致敏（中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感覺神經(jīng)元的過度興奮）等因素共同作用的結(jié)果。然而，以往大量的研究主要是基于對神經(jīng)元的研究，如神經(jīng)元可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)通路等。雖然長期的研究已積累了大量的資料，但疼痛機(jī)制仍未明了，而且依據(jù)神

3、經(jīng)元痛覺學(xué)說設(shè)計的鎮(zhèn)痛措施并不理想。從上世紀(jì)九十年代早期，研究者開始關(guān)注神經(jīng)系統(tǒng)的另一種細(xì)胞即神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞在慢性疼痛的病理過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　 雖然神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量比神經(jīng)元的數(shù)量多得多，但在神經(jīng)科學(xué)研究的漫長歷程中，膠質(zhì)細(xì)胞一直被認(rèn)為在神經(jīng)系統(tǒng)只發(fā)揮輔助作用，在神經(jīng)功能活動中如信息的感受、傳輸、處理過程不發(fā)揮作用。如星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為僅僅具有支持、保護(hù)和營養(yǎng)神經(jīng)元的作用。而近期的研究證實，神經(jīng)

4、膠質(zhì)細(xì)胞通過與神經(jīng)元相互作用參與各種神經(jīng)功能活動的調(diào)控。在各種疼痛模型中包括外周或中樞的神經(jīng)損傷或炎性痛，動物除表現(xiàn)慢性疼痛的癥狀（如熱痛覺敏感和機(jī)械性觸誘發(fā)痛）外，還出現(xiàn)了脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化。在神經(jīng)組織損傷或發(fā)生炎癥后，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以從靜息態(tài)轉(zhuǎn)化為激活態(tài)，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞除表現(xiàn)出形態(tài)改變外，還合成和釋放大量神經(jīng)活性物質(zhì)，包括神經(jīng)遞質(zhì)（興奮性氨基酸、ATP、NO等）和細(xì)胞因子（NO、IL-1β、IL-6和TNF-α）等，由此參與痛信

5、號的傳遞與調(diào)制。雖然二十年的研究明確證實了膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛信號傳遞、感受、調(diào)制的重要作用，但由于神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞形成一個混合的網(wǎng)絡(luò)體系，因此現(xiàn)有的各實驗體系無法對膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛產(chǎn)生過程激活和作用機(jī)制進(jìn)行詳盡研究，如各種刺激如何激活膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，何種刺激通過哪種受體，作用如何；膠質(zhì)細(xì)胞如何與神經(jīng)元相互作用參與疼痛信號處理，如通過產(chǎn)生何種物質(zhì)（如細(xì)胞因子或神經(jīng)遞質(zhì)）如何作用于神經(jīng)元以及作用強(qiáng)度、過程均無確切機(jī)

6、制。事實上神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的相互作用由于上述原因（神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞組成一個混合的網(wǎng)絡(luò)體系）一直未有明確的結(jié)論，影響了對膠質(zhì)細(xì)胞在各種功能活動調(diào)控（包括參與疼痛信號的感受、傳遞、整合）中的作用的深入理解。谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過不同種類的受體（包括離子型和代謝型受體）在神經(jīng)生理及病理過程發(fā)揮重要作用。雖然已經(jīng)有證據(jù)顯示，谷氨酸通過不同的受體在外周及脊髓痛信號感受、傳遞、調(diào)制過程發(fā)揮重要作用，但這種作用是基于對

7、神經(jīng)元、膠質(zhì)組成的混合網(wǎng)絡(luò)體系的作用觀察，而它對膠質(zhì)細(xì)胞的作用如對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，如是否會直接刺激活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，是否會通過刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子（白介素等）參與疼痛信號處理等尚無報道。
　　 目的：
　　 1.通過離體培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞觀察谷氨酸對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用，包括形態(tài)學(xué)觀察及IL-6的檢測；
　　 2.利用痛行為檢測方法觀察經(jīng)谷氨酸刺激活化的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞對動物痛行為的影響。

8、　　 方法：
　　 1．原代培養(yǎng)雄性Wistar大鼠（出生后1-2天）的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)9-14天后，將細(xì)胞分為14組：(1)空白對照組，細(xì)胞孵育全培液；(2)ATP組（陽性對照），全培液+50μM ATP 孵育1小時；(3)全培液+谷氨酸500μM 1h、6 h、12 h和24 h組；(4) 全培液+谷氨酸1000μM 1h、6 h、12 h和24 h組；(5) 全培液+谷氨酸2000μM 1h、6 h、12 h和

9、24 h組。
　　 2．用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定GFAP 陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并觀察細(xì)胞活化后形態(tài)的變化。
　　 3．用ELISA 試劑盒檢測大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6蛋白水平（反映星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的指標(biāo)）的表達(dá)水平，從而觀察谷氨酸活化脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的相應(yīng)濃度和時間過程。
　　 4．用Real-Time PCR 法檢測大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)水平，從mRNA水平觀察谷氨酸活化脊髓星形膠質(zhì)

10、細(xì)胞的情況。
　　 5．將在體外被激活的脊髓星形細(xì)胞通過鞘內(nèi)插管注射到成年Wistar 雄性大鼠（約200g）的脊髓腰膨大部位，分別在細(xì)胞注射前和注射后2 h、4 h和6 h 檢測大鼠的熱痛覺敏感反應(yīng)（PWL），觀察活化的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在熱痛覺敏感中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1．采用GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)的方法鑒定出培養(yǎng)的細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 2．以全培液組為空白對照組，ATP組為陽性對照組，谷

11、氨酸500μm24 h組細(xì)胞部分發(fā)生形態(tài)變化，胞體變圓、突起收縮；而谷氨酸1000μM和2000μM組，細(xì)胞形態(tài)從6 h 即開始改變，逐漸到24 h 谷氨酸對細(xì)胞的作用強(qiáng)度達(dá)到最大（該時間為本實驗研究的最后一個時間點(diǎn)）。
　　 3．IL-6蛋白檢測結(jié)果顯示，谷氨酸500μM在4個時間點(diǎn)的IL-6水平與空白對照組(10.81±2.87)相比，均無統(tǒng)計學(xué)差異。而谷氨酸1000μM和谷氨酸2000μM組，IL-6 含量從6小時開始明顯

12、增加(分別為153.30±2.08和69.41±18.14)，并隨時間逐漸上升。但谷氨酸2000μM組IL-6 比1000μM組相比較低。IL-6 含量在谷氨酸1000μm24 h組(426.53±33.89)達(dá)到最高(p<0.05)。
　　 4．IL-6 mRNA 檢測結(jié)果顯示，與空白對照組(1.05±0.17)相比，IL-6 轉(zhuǎn)錄水平在谷氨酸500μM作用于細(xì)胞24 h（17.77±2.32，P<0.05）大大增加；在谷氨酸

13、1000μM和2000μM組作用細(xì)胞6 h，IL-6 開始轉(zhuǎn)錄增加（分別為4.52±0.96和3.47±0.30，P<0.05）；谷氨酸濃度為500μM、1000μM和2000μM作用于細(xì)胞24 h（本實驗研究的最后一個時間點(diǎn)），IL-6 轉(zhuǎn)錄水平明顯增加(分別為17.77±2.32、22.43±1.42和24.12±3.14，P<0.05)，且呈濃度依賴性上升趨勢。
　　 5．上述實驗結(jié)果提示，谷氨酸激活脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的有效

14、濃度為1000μM和2000μM，有效時間點(diǎn)為6 h、12 h和24 h。
　　 6．將谷氨酸刺激活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞注射入成年大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在注射后2小時，大鼠的PWL 開始明顯降低(P<0.05)，并且在注射后4 h和6 h 隨時間逐漸降低（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　1．谷氨酸可以直接活化脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，其有效濃度為1000μM，時間需持續(xù)6 h以上。
　　2．通過谷氨酸激活的脊