腦內(nèi)組胺H1受體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸代謝通路的調(diào)控作用.pdf

1、谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。然而大量的谷氨酸會(huì)過度地激活谷氨酸受體，導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，這就是所謂的興奮性毒性。興奮性毒性被認(rèn)為是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、腦缺血以及神經(jīng)退行性疾病的重要病理機(jī)制。近年來人們嘗試通過阻斷谷氨酸受體來阻止興奮性毒性的產(chǎn)生，但是這些候選藥物在臨床實(shí)驗(yàn)中往往表現(xiàn)的差強(qiáng)人意，并伴隨著嚴(yán)重的副作用。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)那些能在不影響谷氨酸能系統(tǒng)正常生理功能的情況下，干預(yù)谷氨酸的水平并阻止谷氨酸興奮性毒性的

2、作用靶點(diǎn)是十分有必要的。越來越多的證據(jù)顯示，腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞在控制細(xì)胞外谷氨酸含量和防止興奮性毒性的產(chǎn)生中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。由于缺乏細(xì)胞外的代謝途徑，谷氨酸在被釋放到突觸間隙后，主要被星形膠質(zhì)細(xì)胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLT-1，GLAST)所攝取，并在胞內(nèi)被谷氨酰胺合成酶(GS)轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺。之后，谷氨酰胺再被轉(zhuǎn)運(yùn)回谷氨酸能或γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元內(nèi)作為合成谷氨酸和GABA的原料。上述的這一過程即被稱為谷氨

3、酸-谷氨酰胺循環(huán)。影響這一和星形膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)的谷氨酸代謝通路，特別是其中的重要元件如谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酰胺合成酶都會(huì)對(duì)谷氨酸、GABA的代謝平衡，甚至興奮性毒性產(chǎn)生重要影響。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸代謝通路中的這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)也被視為了解相關(guān)疾病如癲癇、腦缺血等的發(fā)病機(jī)制、干預(yù)疾病發(fā)生發(fā)展的重要潛在靶點(diǎn)。
　　 組胺是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)。組胺能神經(jīng)元位于下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核，并廣泛投射到全腦各個(gè)區(qū)域?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)四種組胺的受體

4、(H1-H4受體)，其中H1-H3受體主要表達(dá)在大腦的神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞中。腦內(nèi)組胺主要和睡眠-覺醒，能量代謝等生理功能相關(guān)。此外，組胺也被認(rèn)為是一種內(nèi)源性的腦保護(hù)因子。大量的文獻(xiàn)報(bào)道腦內(nèi)組胺及其受體在癲癇、缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都發(fā)揮了重要的神經(jīng)保護(hù)作用，但目前為止其機(jī)制尚不十分清楚。
　　 課題組和前人的研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)組胺在病理情況下發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的同時(shí)也會(huì)影響谷氨酸的水平。而組胺受體、特別是H1受體也可能參與其中。那么，組

5、胺及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中所發(fā)揮的作用是否是通過影響了膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸代謝通路及其中的關(guān)鍵蛋白而產(chǎn)生的呢？因此，我們首先在與谷氨酸興奮性關(guān)系最為密切的癲癇模型中，確認(rèn)了組胺H1受體拮抗劑這一廣泛應(yīng)用于臨床的藥物對(duì)癲癇易感性的作用，并研究了該作用是否通過影響了谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)中的關(guān)鍵蛋白GS而產(chǎn)生。除此之外，我們還在所得結(jié)果的提示下進(jìn)一步探討了組胺及其受體對(duì)谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)中的另一關(guān)鍵成分GLT-1的作用，并評(píng)價(jià)了該作用對(duì)另一種重要

6、的神經(jīng)系統(tǒng)疾病腦缺血的影響。
　　 第一部分長(zhǎng)期給予組胺H1受體拮抗劑通過抑制谷氨酰胺合成酶增加癲癇易感性
　　 若每天給予成年大鼠組胺H1受體拮抗劑苯海拉明或吡拉明腹腔注射且持續(xù)兩周，在停藥的第1、5和10天，其戊四唑(PTZ)誘發(fā)的癲癇發(fā)作等級(jí)都明顯提高。在停藥10天后，其后放電閾值明顯降低，杏仁核電點(diǎn)燃進(jìn)程明顯加快，提示長(zhǎng)時(shí)間阻斷H1受體會(huì)導(dǎo)致癲癇易感性的增加。同時(shí)，檢測(cè)皮層和海馬的GS表達(dá)和活性都發(fā)現(xiàn)了明顯的下調(diào)

7、。與此對(duì)應(yīng)，皮層和海馬內(nèi)的谷氨酰胺和GABA的含量也顯著下降。用GS的特異性抑制劑methionine sulfoximine(MSO)模擬H1受體拮抗劑所導(dǎo)致的GS活性下降同樣可以造成癲癇易感性的增加。而在苯海拉明長(zhǎng)期處理且停藥10天后補(bǔ)充谷氨酰胺則可以完全逆轉(zhuǎn)癲癇易感性的增加。在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，長(zhǎng)時(shí)程的苯海拉明和吡拉明處理同樣會(huì)減少GS的表達(dá)，且在停藥后不會(huì)立即恢復(fù)，但是可以被共同給予組胺或H1受體激動(dòng)劑histamine

8、 trifluoromethyl toluidide(HTMT)所逆轉(zhuǎn)。因此，我們的研究表明長(zhǎng)期給予H1受體拮抗劑且停藥后可以在正常大鼠上引起持續(xù)性癲癇易感性上升，它的機(jī)制可能是阻斷H1受體后，抑制了GS的表達(dá)和活性，從而導(dǎo)致腦內(nèi)谷氨酸和GABA的失衡。這提示腦內(nèi)組胺可能通過H1受體調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸代謝通路中的關(guān)鍵酶GS，從而影響GABA、谷氨酸的含量及神經(jīng)元興奮性。
　　 第二部分組胺上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1的表達(dá)從而

9、減輕神經(jīng)損傷
　　 基于上一部分結(jié)果，我們進(jìn)一步考察了組胺及其受體是否對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸代謝通路中的另一重要元件谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體也有調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)組胺可以在急性海馬腦片中特異性地上調(diào)GLT-1的表達(dá)，但對(duì)GLAST卻沒有影響，并且這一作用并不是通過組胺對(duì)神經(jīng)活動(dòng)的影響而產(chǎn)生的。在純培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)組胺同樣能夠上調(diào)GLT-1的表達(dá)。H1受體拮抗劑可以阻斷組胺在腦片或者培養(yǎng)細(xì)胞上對(duì)GLT-1的這種調(diào)節(jié)作用。生物素標(biāo)記

10、細(xì)胞表面膜蛋白顯示組胺在上調(diào)GLT-1總蛋白的同時(shí)也上調(diào)了細(xì)胞膜上的GLT-1表達(dá)量。同時(shí)，電生理記錄膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的電流更證實(shí)了組胺能夠增加有功能的GLT-1的量，提示GLT-1介導(dǎo)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力的提升。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中我們又發(fā)現(xiàn)，組胺(10-6 M)處理24小時(shí)后可以明顯降低胞外谷氨酸的含量，并減輕外源性谷氨酸(2 mM)刺激引起的興奮性毒性損傷。這種保護(hù)作用可以被GLT-1的特異性抑制劑dihydrokainate(DHK

11、)所阻斷。最后，我們又發(fā)現(xiàn)組胺可以在腦片中顯著減輕糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)引起的神經(jīng)損傷。同樣的，在在體的缺血模型大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)中，我們腹腔注射了組胺的前體物質(zhì)組氨酸（組胺難以透過血腦屏障）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)組氨酸可以明顯減少M(fèi)CAO所引起的腦梗死體積，并且逆轉(zhuǎn)MCAO所引起的GLT-1表達(dá)量下降。以上的結(jié)果提示，組胺可

12、以通過膠質(zhì)細(xì)胞上的H1受體上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞中GLT-1的表達(dá)量和功能，繼而降低胞外谷氨酸的水平，在缺血性損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 總之，本課題發(fā)現(xiàn)H1受體拮抗劑長(zhǎng)時(shí)間處理可以降低GS的表達(dá)和活性，并且該作用可以在撤藥后長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)。這可能是H1受體被長(zhǎng)期阻斷后增加癲癇易感性的機(jī)制。此外，組胺通過H1受體可以上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸代謝通路中的另一關(guān)鍵環(huán)節(jié)GLT-1，從而降低細(xì)胞外谷氨酸含量，在興奮性毒性、缺血性損傷中起到神經(jīng)保護(hù)的