布魯菌新型亞單位疫苗BP26的動(dòng)物免疫評價(jià).pdf

1、目的：
　　 通過重組布魯菌BP26蛋白與鋁佐劑和CpG佐劑聯(lián)用分別免疫Balb/c小鼠和豚鼠，從細(xì)胞免疫及體液免疫兩方面評價(jià)布魯菌重組BP26亞單位疫苗生物學(xué)活性，以及布魯菌攻擊實(shí)驗(yàn)評價(jià)其免疫保護(hù)效果；為新型布魯菌疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、布魯菌BP26蛋白的小鼠免疫評價(jià)：
　　 ①以布魯菌BP26蛋白及分別聯(lián)合鋁佐劑、CpG佐劑免疫小鼠，分別設(shè)立NS組，鋁佐劑組，CpG佐劑組，

2、BP26蛋白+鋁佐劑組，BP26蛋白+CpG佐劑組。分別于0d，14d肌肉注射免疫各組小鼠后，檢測小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)；
　　 ②MTT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖；
　　 ③流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞類分群；
　　 ④ELISpot方法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌；
　　 ⑤ELISpot方法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-4的分泌；
　　 ⑥ELISA方法檢測小鼠血清總I

3、gG抗體水平；
　　 ⑦ELISA方法檢測小鼠血清抗體亞類IgG1，IgG2a；
　　 ⑧用牛種布魯菌104M菌株（Brucella abortus，104M）對免疫后的小鼠進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)，觀察疫苗的保護(hù)效果。
　　 2、布魯菌BP26蛋白豚鼠的免疫評價(jià)：
　　 ①以布魯菌BP26蛋白及分別聯(lián)合鋁佐劑、CpG佐劑免疫豚鼠，分別設(shè)立NS組，鋁佐劑組，CpG佐劑組，BP26蛋白+鋁佐劑組，BP26蛋白+CpG佐

4、劑組。分別于0d，14d肌肉注射免疫豚鼠；
　　 ②豚鼠皮膚試驗(yàn)檢測豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)；
　　 ③ELISA方法檢測豚鼠血清總IgG抗體水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、布魯菌BP26蛋白小鼠免疫評價(jià)檢測結(jié)果：
　　 ①小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果：BP26蛋白組、BP26蛋白+鋁佐劑組和BP26蛋白+CpG佐劑組小鼠與相應(yīng)對照組NS組，鋁佐劑組和CpG佐劑組比較，疫苗組小鼠淋巴細(xì)胞分別經(jīng)BP26蛋白

5、、Br.PPD和布魯菌可溶性蛋白體外刺激后，刺激指數(shù)（SI）明顯高于對照組 (p<0.05)；
　　 ② ELISpot檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌的結(jié)果：疫苗組小鼠淋巴細(xì)胞在經(jīng)BP26蛋白和Br.PPD體外刺激后IFN-γ的分泌多于對照組（p<0.05）；
　　 ③ ELISpot檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-4分泌的結(jié)果：BP26+鋁佐劑組的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于其他各組（p<0.05），其余各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）

6、；
　　 ④ 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血淋巴細(xì)胞分群結(jié)果：BP26蛋白組和BP26+鋁佐劑組小鼠外周血中CD4+淋巴細(xì)胞比例增高，CD4+/CD8+比值高于NS組及鋁佐劑組(p<0.05)，而BP26蛋白+CpG組小鼠外周血中CD8+淋巴細(xì)胞比例增加，CD4+/CD8+比值低于CpG組（p<0.05）；
　　 ⑤ ELISA檢測小鼠血清總IgG抗體效價(jià)結(jié)果：BP26組與BP26+CpG組效價(jià)均為1：3200，BP26+Al

7、組效價(jià)為1：29405；
　　 ⑥ ELISA檢測小鼠血清抗體亞類效價(jià)結(jié)果：IgG1與IgG2a的效價(jià)均以BP26+Al免疫組最高，IgG1效價(jià)為1：67558，IgG2a效價(jià)為1：8445，IgG1/IgG2a>1；
　　 ⑦ 布魯菌攻擊小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果：BP26蛋白免疫組與NS組比較，脾臟細(xì)菌定值數(shù)減少。BP26+CpG組小鼠脾菌數(shù)與CpG組比較有減少，p<0.05。
　　 2、布魯菌BP26蛋白豚鼠免疫評價(jià)檢測

8、結(jié)果：
　　 ① 豚鼠皮膚實(shí)驗(yàn)結(jié)果：BP26、BP26+Al和BP26+CpG組紅腫直徑都大于10mm，而鹽水組豚鼠無法檢測到紅腫，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異性；
　　 ② ELISA檢測豚鼠血清總IgG抗體：疫苗組豚鼠血清A450值在1.46-2.41之間，而對照組豚鼠血清A450值僅為0.4-0.6，疫苗組與對照組差異有顯著性，p<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、BP26蛋白能激活小鼠機(jī)體免疫系統(tǒng)，包括細(xì)胞免疫

9、和體液免疫。
　　 2、BP26蛋白+鋁佐劑和BP26+CpG對小鼠的體液免疫及細(xì)胞免疫的刺激效應(yīng)均強(qiáng)于不含佐劑的BP26蛋白。BP26+鋁佐劑刺激的體液免疫強(qiáng)于BP26+CpG，而BP26+CpG刺激的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)于其對體液免疫的刺激。
　　 3、BP26蛋白+CpG具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，小鼠脾臟細(xì)菌定植數(shù)最少。
　　 4、通過免疫豚鼠，證明免疫BP26的豚鼠不僅其血清抗體滴度高，而且能夠形成明顯的遲發(fā)型變