阿維菌素殺螨活性作用靶標(biāo)及其抗性相關(guān)基因鑒定.pdf

1、阿維菌素類藥劑是一種具有良好活性的殺蟲、殺螨和殺線蟲劑，目前被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)害蟲以及衛(wèi)生害蟲的防治，其發(fā)現(xiàn)者日本科學(xué)家大村智和愛爾蘭科學(xué)家坎貝爾也據(jù)此獲得了2015年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。阿維菌素類殺蟲劑的毒理學(xué)機(jī)制和害蟲對(duì)其的抗性機(jī)制研究是殺蟲劑毒理學(xué)的熱點(diǎn)之一，但在葉螨中的研究目前仍然十分缺乏。目前，阿維菌素對(duì)葉螨的毒理學(xué)機(jī)制研究主要存在以下兩個(gè)問題：一是葉螨對(duì)阿維菌素的抗性機(jī)制主要集中于已知代謝酶及其編碼基因的研究，是否存在其它類

2、型的基因參與葉螨對(duì)阿維菌素抗性的形成；二是阿維菌素對(duì)葉螨作用的分子靶標(biāo)以及靶標(biāo)抗性機(jī)制尚不明確。因此，本論文以“朱砂葉螨-阿維菌素類殺螨劑”為研究對(duì)象，以解決以上兩個(gè)問題為研究目標(biāo)，進(jìn)行了朱砂葉螨阿維菌素抗性基因及分子靶標(biāo)鑒定的系統(tǒng)研究，取得了以下研究成果：
　　1.朱砂葉螨敏感及阿維菌素抗性品系基因芯片檢測(cè)
　　在表達(dá)譜測(cè)序獲得敏感及阿維菌素抗性品系間差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上，運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證這些差異表達(dá)基因。檢測(cè)結(jié)

3、果顯示：相對(duì)于敏感品系，阿維菌素抗性品系共有52條差異表達(dá)基因（21條表達(dá)上調(diào)，31條表達(dá)下調(diào)）；差異表達(dá)基因Gene Ontology（GO）功能注釋發(fā)現(xiàn)其中14條差異表達(dá)基因可以注釋到12個(gè)GO分類；參考二斑葉螨基因組對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋和分析，發(fā)現(xiàn)抗性品系中上調(diào)表達(dá)基因包括兩條谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-Transferase，GST)基因，一條細(xì)胞色素P450基因和一條酯酶基因；下調(diào)表達(dá)基因中包括6條表皮蛋白

4、基因；此外我們也首次發(fā)現(xiàn)大量其它基因可能與阿維菌素抗性相關(guān)，如內(nèi)環(huán)裂解雙加氧酶（Intradiol ring-cleavage dioxygenases，ID-ICDs）、絲氨酸蛋白酶（Serine proteases，SPs）、組織蛋白酶L（Cathepsin L）等。
　　2.朱砂葉螨谷氨酸氯離子通道，γ-氨基丁酸氯離子通道基因克隆及其表達(dá)模式分析
　　從朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄組中獲得了5條谷氨酸氯離子通道（Glutamate-g

5、ated chloride channel，GluCls）及3條γ-氨基丁酸氯離子通道(Gamma amino butyric acid-gated chloride channel，GABACls)基因序列，設(shè)計(jì)特異引物克隆獲得了這8條基因cDNA全長(zhǎng)（GeneBank登錄號(hào)為KT284894-KT284901）。序列比對(duì)結(jié)果表明，朱砂葉螨8條氯離子通道基因與其它物種的同源基因有著較大的相似性，尤其與其姊妹種二斑葉螨的相似度最高。將朱

6、砂葉螨氯離子通道基因與昆蟲GABA氯離子通道、谷氨酸氯離子通道基因以及二斑葉螨基因組測(cè)序獲得的28條半胱氨酸門控離子通道基因進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)朱砂葉螨GABACls基因和GluCls基因均可以與其對(duì)應(yīng)的其它物種中的同源基因分類到同一分支；此外，朱砂葉螨GABA氯離子通道基因與二斑葉螨及其它昆蟲的RDL基因（GABACl亞基）親緣性最近，說明3條GABA氯離子通道基因均屬于RDL同源基因，但在朱砂葉螨中未發(fā)現(xiàn)有GRD和LCCH同源基因（G

7、ABACl亞基）。采用定量PCR技術(shù)解析8條氯離子通道基因在朱砂葉螨不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，結(jié)果顯示所有基因在卵期的表達(dá)量相對(duì)最低，在其它螨態(tài)之間也略有差異。
　　3.朱砂葉螨氯離子通道基因在爪蟾卵母細(xì)胞中的表達(dá)
　　使用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了5條GluCls和3條GABACls基因。在特異性神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸或GABA）的刺激下，卵母細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)向電流，據(jù)此明確了基因編碼通道蛋白的生理功能。通道蛋白的檢測(cè)電流與谷氨酸或

8、是GABA灌流呈現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)，并據(jù)此計(jì)算5條谷氨酸氯離子通道蛋白的EC50值為TcGluCl2（3.019±0.0354 M）>TcGluCl3（2.983±0.0181 M）>TcGluCl1（2.884±0.0472 M）>TcGluCl4（2.851±0.0340 M）>TcGluCl5（2.701±0.0380 M）；3條GABA氯離子通道蛋白的EC50值為TcRDL3（1.086±0.032 M）>TcRDL2（0.67

9、7±0.042 M）>TcRDL1（0.445±0.047 M）。
　　4.阿維菌素殺螨作用分子靶標(biāo)的鑒定
　　通過RNAi技術(shù)沉默朱砂葉螨5條GluCls基因后，朱砂葉螨對(duì)阿維菌素的敏感性下降；同樣地，沉默3條GABACls基因后，朱砂葉螨對(duì)阿維菌素的敏感性也下降。而電生理學(xué)研究表明5條GluCls對(duì)阿維菌素和伊維菌素均敏感，并且對(duì)阿維菌素的電流反應(yīng)要大于伊維菌素；3條GABACls對(duì)阿維菌素和伊維菌素均不敏感。綜合電生理