Thermobifida fusca產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶基因的克隆、表達及分子改造.pdf

1、淀粉酶是一類重要的工業(yè)用酶，目前淀粉酶的主要工業(yè)用途是用于生產(chǎn)葡萄糖和麥芽糖。大多數(shù)的α-淀粉酶催化水解淀粉產(chǎn)生大量糊精和葡萄糖，但也有報道，有些α-淀粉酶水解淀粉主要產(chǎn)物是麥芽糖。麥芽糖因具有甜度低、吸潮性低、防止淀粉老化等優(yōu)良性質(zhì)而廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域，因而尋找高產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶成為淀粉酶工業(yè)領(lǐng)域中一個研究熱點。
　　 本研究以T．fusca基因組DNA為模板，PCR分別擴增不包括和包括其基因前段信號肽的α

2、-淀粉酶基因片段（tfa），并克隆至表達載體pSE380上，獲得重組質(zhì)粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa，以大腸桿菌JM109為宿主細胞大量表達融合蛋白，利用金屬鎳親和層析對菌株JM109/pSE380-tfa表達的α-淀粉酶進行純化，SDS-PAGE顯示純化蛋白的分子量約為64kD，純化后的酶比活力為145.0U/mg，最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH為7.0；檢測到菌株JM109/pSE380-sptfa的培養(yǎng)基上清有相

3、當(dāng)一部分酶活，對其進行濃縮后，SDS-PAGE顯示有少量目的蛋白。
　　 本研究采用半理性設(shè)計方法，以Yellow meal worm alpha-amylase（PDB ID：ljae）晶體結(jié)構(gòu)為模板，通過SWISS-MODEL網(wǎng)站對T．fusca的α-淀粉酶基因進行同源建模，然后分析模板中的關(guān)鍵位點，使用ProSa2003能量分析軟件計算確定將tfa催化位點的D187、E221和D281（氨基酸序列為去掉信號肽后的序列）作為

4、定點飽和突變位點；同時比對分析不同來源的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶基因的保守序列，選擇了保守區(qū)的位點A182、V275/V278、G294、H360、D408/V410進行定點突變以提高麥芽糖的產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對D187、E221和D281三個氨基酸任何一個進行點突變都會導(dǎo)致酶活的明顯下降或者喪失；突變子A182D、雙突變子V275T/V278D和D408A/V410T的比活力均大大降低；與野生型相比，G294R（酶命名為tfm）和H360R（酶