菊芋發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究.pdf

1、近年來，國內(nèi)外對L-乳酸的需求日趨增加，而我國L-乳酸的生產(chǎn)技術(shù)比較落后。菊芋作為一種生長能力強、抗鹽堿、耐沙漠的作物，其在我國中西部地區(qū)的種植面積正以基地的形式逐年加大。菊芋深加工的研究引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，然而開展菊芋發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究尚未見報道。由于乳酸菌自身不能利用菊粉，本研究采用一株菊粉酶活力較強的黑曲霉為產(chǎn)酶菌株，以乳酸桿菌G-01為L-乳酸生產(chǎn)出發(fā)菌株，對以菊芋為原料的L-乳酸的發(fā)酵法生產(chǎn)進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容及結(jié)

2、果如下：
　　 (1)通過對黑曲霉產(chǎn)菊粉酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基組成：葡萄糖40g/L，蛋白胨30 g/L和蔗糖脂4 g/L。并在該優(yōu)化條件下于30℃，140 r/min下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，96h后菊粉酶酶活力達(dá)到230U/mL。進(jìn)一步研究表明菊粉酶是一種誘導(dǎo)酶，從誘導(dǎo)效果上看，蔗糖酯相對于菊粉是一種更有效的合成誘導(dǎo)劑，該物質(zhì)可以激活用于生產(chǎn)菊粉酶的mRNA的合成。同時由于蔗糖酯在溶液中相對于菊粉，更難水解，所以有著更強的

3、和持續(xù)的誘導(dǎo)作用。研究還發(fā)現(xiàn)在使用葡萄糖作為碳源，蔗糖酯作為合成促進(jìn)劑時，更有利于菌絲體的生長和酶的合成。通過對該株菌的基因和形態(tài)學(xué)分析，確定其為黑曲霉。
　　 (2)菊粉酶的提取，先采用30％飽和度的硫酸銨鹽析，沉淀除雜，然后采用70％飽和度鹽析，經(jīng)透析除鹽，聚乙二醇20000濃縮，得到總酶活25253U，單位酶活1262 U/mL，比酶活64.37 U/mg，回收率83％，純化倍數(shù)2.36。進(jìn)一步純化表明黑曲霉產(chǎn)菊粉酶是由兩

4、種分子量相差較小的內(nèi)切酶和外切酶組成，前者分子量在165～210 kDa，而后者的分子量在160～170 kDa。比較轉(zhuǎn)化酶和菊粉酶在30℃的催化動力學(xué)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化酶的Km=34.9 mmol/L，Vm=909μmol/min，菊粉酶的Km=68.3 mmol/L，Vm=476.2μmol/min，這表明轉(zhuǎn)化酶的最大反應(yīng)速率接近菊粉酶的2倍，然而達(dá)到最大反應(yīng)速率所需底物的濃度卻接近菊粉酶的一半。
　　 (3)通過DES和NTG對乳

5、酸桿菌G-01進(jìn)行誘變，并進(jìn)行耐滲透馴化，使菌株以葡萄糖為底物產(chǎn)酸達(dá)到92.8g/L，提高了近1倍。乳酸菌G-02菌株經(jīng)過多次傳代接種，表現(xiàn)出較好的傳代穩(wěn)定性。通過對該菌株的基因、形態(tài)學(xué)及代謝產(chǎn)物分析，確定其為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，乳酸同型發(fā)酵，而且產(chǎn)物中L-乳酸的光學(xué)純度達(dá)到95％以上，為一株較為理想的L-乳酸生產(chǎn)菌株。
　　 (4)為了消除菊粉酶合成體系中的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，降低發(fā)酵液中黑曲霉菌絲

6、體密度，同時避免在同步糖化與發(fā)酵菊芋產(chǎn)乳酸工藝中的染菌問題，使乳酸桿菌在菊芋糖化酶液中提前形成優(yōu)勢菌群，本研究采用在黑曲霉產(chǎn)酶培養(yǎng)基中適時接入乳酸菌的混合培養(yǎng)工藝，并對混合培養(yǎng)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在產(chǎn)酶培養(yǎng)開始12 h接入乳酸桿菌，可以顯著提高黑曲霉后期產(chǎn)菊粉酶的活性，在優(yōu)化的培養(yǎng)基中，經(jīng)過60 h的培養(yǎng)，菊粉酶活力將達(dá)到250 U/mL，較參照水平(50 U/mL)提高了近4倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的接入顯著地降低了發(fā)酵液

7、中可發(fā)酵性糖的濃度，發(fā)酵液中黑曲霉菌絲體濃度降低到參照的一半，而且黑曲霉的菌絲體形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，從而更有利于生存在競爭的環(huán)境中。
　　 (5)對采用同步糖化與發(fā)酵工藝?yán)镁沼笊a(chǎn)L-乳酸的工藝進(jìn)行了探索，研究發(fā)現(xiàn)最適發(fā)酵工藝為菊粉酶活量50U/mL，接種量為35％，菊芋粉抑制濃度為230g/L，碳酸鈣濃度50g/L。為了進(jìn)一步提高乳酸發(fā)酵活力，將檸檬酸代謝引入乳酸發(fā)酵工藝，結(jié)果表明：檸檬酸代謝可以顯著提高乳酸桿菌的抗酸脅迫