米根霉半連續(xù)高強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸研究.pdf

1、L-乳酸是一種重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化工中，利用L-乳酸制備的聚L-乳酸是一種新型的可生物降解材料。細(xì)菌發(fā)酵和真菌發(fā)酵是發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的主要方法，其中米根霉具有營養(yǎng)要求簡單、可進(jìn)行同步糖化發(fā)酵、產(chǎn)酸光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)化生產(chǎn)最有潛力的菌株之一。但是，目前米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸仍然存在發(fā)酵強(qiáng)度低、原料利用率不高、菌體形態(tài)難以控制等問題。
　　 本文以米根霉AS3.819為生產(chǎn)菌株，以提高L-乳酸產(chǎn)率及發(fā)酵

2、強(qiáng)度為主要目標(biāo)，研究米根霉半連續(xù)高強(qiáng)度發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的關(guān)鍵技術(shù)。通過優(yōu)化搖瓶發(fā)酵條件，進(jìn)行米根霉菌絲球半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸和罐發(fā)酵試驗(yàn)，建立其動(dòng)力學(xué)模型，分析發(fā)酵中菌絲球的生長過程，并采用計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)(CFD)模擬技術(shù)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行模擬優(yōu)化。主要研究結(jié)論如下：
　　 (1)通過對(duì)種子培養(yǎng)條件及半連續(xù)發(fā)酵條件的優(yōu)化，獲得搖瓶中米根霉菌絲球半連續(xù)高強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的控制模式：首批發(fā)酵中250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，

3、接種量10％，種子液32℃培養(yǎng)24 h，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵前期(0～36 h)溫度為28～30℃，發(fā)酵后期(36～72 h)溫度為32～34℃：重復(fù)批次發(fā)酵中每批發(fā)酵24 h。該發(fā)酵條件下，半連續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵30批，首批發(fā)酵菌絲球直徑穩(wěn)定控制為0.8～1.0 mm，其產(chǎn)酸能力較高，發(fā)酵強(qiáng)度為1.58g/(L·h)，重復(fù)批次發(fā)酵強(qiáng)度2.67～3.00 g/(L·h)。
　　 (2)研究3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及通

4、氣量對(duì)米根霉首批發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響，建立了米根霉菌絲球高強(qiáng)度發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的控制模式：發(fā)酵0～30 h溫度32～34℃、攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min、通氣量1.5 L/(L·min)，30～60 h溫度34～36℃、攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min、通氣量0.5 L/(L·min)；該條件下，菌絲球直徑穩(wěn)定控制為0.9～1.2 mm，其產(chǎn)酸能力較高，發(fā)酵強(qiáng)度為2.51g/(L·h)。對(duì)重復(fù)批次發(fā)酵中葡萄糖質(zhì)量濃度、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量對(duì)發(fā)酵

5、強(qiáng)度的影響進(jìn)行研究，得到3 L發(fā)酵罐中重復(fù)批次發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的控制模式：補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度100 g/L，溫度34～36℃、攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min、通氣量0.5 L/(L·min)，半連續(xù)發(fā)酵5批，每批發(fā)酵周期為20 h，發(fā)酵強(qiáng)度大于3.80 g/(L·h)。
　　 (3)補(bǔ)料培養(yǎng)基中N源及無機(jī)鹽質(zhì)量濃度對(duì)半連續(xù)發(fā)酵過程影響的研究表明，N源和無機(jī)鹽是半連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定進(jìn)行不可缺少的因素；生物量在一定范圍內(nèi)增加，不能提高

6、其發(fā)酵強(qiáng)度，在半連續(xù)發(fā)酵中間歇取出部分菌體保持DCW為10 g/L左右，可以維持高強(qiáng)度發(fā)酵。采用以上優(yōu)化發(fā)酵條件，7 L發(fā)酵罐中米根霉半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸25批，首批發(fā)酵強(qiáng)度為2.47 g/(L·h)，第2～20批發(fā)酵強(qiáng)度3.40～3.85g/(L·h)，實(shí)現(xiàn)了米根霉半連續(xù)高強(qiáng)度穩(wěn)定發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
　　 (4)對(duì)米根霉半連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸菌體生長、產(chǎn)物生成及底物消耗的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)重復(fù)批次發(fā)酵中每批產(chǎn)物生成及底物消耗

7、曲線接近于直線。選擇Logistic及Luedeking-Piret方程作為米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的動(dòng)力學(xué)方程，運(yùn)用Matlab軟件將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，對(duì)方程中關(guān)鍵參數(shù)求解，建立米根霉半連續(xù)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，并對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。其中首批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型中Xm為7.6164 g/L、μm/L、為0.1802 h-1、α為3.2631、β為0.5980、p為1.9875、q為1.0232：重復(fù)批次發(fā)酵過程中，對(duì)初始菌體量及L-乳酸產(chǎn)量采用“零處理”

8、方法，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)方程求解，其中第2批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型中Xm為8.246 g/L、μm為0.0087h-1、α為0.9610、β為0.4929、p為3.2438、q為1.0326，δ為98.63％；半連續(xù)發(fā)酵第2批到第10批，每批的生物量逐漸增加，菌體最大比生長速率逐漸減小，菌體重復(fù)利用效率逐漸降低但仍大于90％，最大比產(chǎn)物合成速率逐漸減小。驗(yàn)證試驗(yàn)表明建立的動(dòng)力學(xué)模型能夠很好的描述發(fā)酵過程(R2≥0.98)。
　　 (5)對(duì)搖瓶及

9、發(fā)酵罐中菌體生長過程進(jìn)行分析，菌絲球的形成過程為：孢子萌發(fā)成菌絲，菌絲凝聚在一起形成菌絲元，菌絲元生成具有致密菌核的菌絲球；發(fā)酵后期菌絲球內(nèi)部逐漸形成中空核，且該中空核及菌絲球直徑越來越大；重復(fù)利用多次的菌絲球逐漸破裂成菌片，菌片表面菌絲生長，大部分形成具有菌毛層的菌片，極少部分形成游離菌絲；菌片中心菌絲自溶衰亡形成具有中空核的菌囊；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌囊由于其內(nèi)部菌絲衰亡及流體剪切作用破碎成菌片。半連續(xù)發(fā)酵液中規(guī)則菌絲球、菌片、菌囊3種

10、不同形態(tài)的菌絲球相互轉(zhuǎn)變，其中規(guī)則菌絲球百分比逐漸降低，菌片及菌囊百分比逐漸增加；它們都具有較高的L-乳酸脫氫酶(LDH)活性，共同維持了半連續(xù)高強(qiáng)度發(fā)酵的進(jìn)行。通過石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，具有致密菌核的菌絲球菌體代謝產(chǎn)酸能力較強(qiáng)：具有中空核的菌絲球壁外緣菌體細(xì)胞代謝活力旺盛。
　　 (6)菌絲球大小對(duì)發(fā)酵強(qiáng)度影響比較明顯，直徑過大或過小的菌絲球產(chǎn)酸能力較低，直徑為0.9～1.2 mm的菌絲球，產(chǎn)酸能力較高，有利于高強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)L-乳

11、酸。
　　 (7)采用CFD模擬技術(shù)對(duì)3 L發(fā)酵罐內(nèi)不同轉(zhuǎn)速的流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)行模擬，建立3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵工藝的CFD調(diào)控模式：首批發(fā)酵中剪切速度范圍為0.009～1.582 m/s，重復(fù)批次發(fā)酵中剪切速度范圍為0.009～1.192 m/s：根據(jù)該控制模式，優(yōu)化7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵條件，采用該優(yōu)化發(fā)酵條件米根霉半連續(xù)高強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸20批，其中首批發(fā)酵強(qiáng)度為2.51g/(L·h)，重復(fù)批次發(fā)酵強(qiáng)度為3.58～4.01g/(L