合成阿莫西林用青霉素?；冈诖竽c桿菌中的表達(dá).pdf

1、阿莫西林是一種廣譜性青霉素類半合成抗生素，在我國及世界范圍內(nèi)有著廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用具有特異性、反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物中雜質(zhì)含量少，對(duì)環(huán)境污染小的酶法合成阿莫西林工藝是工業(yè)生產(chǎn)阿莫西林最好的選擇。青霉素G?；?PGA)是催化合成阿莫西林反應(yīng)所用的關(guān)鍵酶，但在阿莫西林的合成過程中還伴隨阿莫西林的水解反應(yīng)。經(jīng)調(diào)研可知來源于Achromobacter sp CCM4824菌上的青霉素?；妇哂休^高的合成活性。
　　 本文通過DNAworks

2、在線分析軟件對(duì)Achromobacter sp CCM4824上的青霉素酰化酶基因進(jìn)行優(yōu)化使其適合在大腸桿菌中表達(dá)，并對(duì)優(yōu)化后的基因直接進(jìn)行人工合成。
　　 利用基因工程手段，將合成的PGA基因分別克隆到pET01-T和pET28a表達(dá)載體中，構(gòu)建了誘導(dǎo)型重組質(zhì)粒pET01-PGA、pET28a-PGA，并將其分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。重組菌BL21(DE3)/pET01-PGA和BL21(DE3)/pET

3、28a-PGA表達(dá)的PGA酶活分別為30U·L-1、105 U·L-1，單位菌體濃度下，后者表達(dá)的PGA酶活比前者高147％。SDS-PAGE顯示二者均有無活性的PGA前體包涵體產(chǎn)生。
　　 為了減少無活性包涵體的形成，構(gòu)建了具有相對(duì)較弱啟動(dòng)PGA表達(dá)的pUCK-lac-PGA、pUCK-HP-PGA組成型表達(dá)質(zhì)粒，通過對(duì)不同宿主菌的選擇，最終確定表達(dá)效果最好的宿主菌為E.coli BL21。重組菌BL21/pUCK-lac-P