基因工程菌株Yarrowia lipolytica 30利用菊芋提取液產檸檬酸的研究.pdf

1、目前檸檬酸的生產主要以富含蔗糖、葡萄糖的原料通過黑曲霉(Aspergillus niger)的深層發(fā)酵方式獲得，但該菌種容易產生大量的固液廢物，并且不利于遺傳改造。近些年來，Yarrowia lipolytica已被考慮作為檸檬酸生產的潛在菌種成為研究的熱點。從經濟角度而言，通過基因工程對Y. lipolytica進行遺傳改造對提高檸檬酸產量具有重要意義。本實驗室已通過基因手段獲得了一株具有菊粉酶活力并敲除ACL1基因且超表達ICL1基

2、因的基因工程菌株Y. lipolytica30，該菌株利用100.0g/l菊粉在發(fā)酵罐中一步發(fā)酵生產檸檬酸，產酸量可達84.0g/l。為了進一步節(jié)約發(fā)酵成本，我們考慮以菊芋提取液作為基因工程菌株Y. lipolytica30的檸檬酸發(fā)酵底物。
　　采用單因素實驗對菊芋中糖分的提取條件進行優(yōu)化，得到最佳的處理條件：料液比1:20，提取時間50 min，提取溫度100℃，HCl濃度0.05M，提取次數4次。將所得的菊芋提取液經Ca(O

3、H)2處理并進行初步的檸檬酸產量測試，其產酸量為24.3g/l，檸檬酸產率為0.39（g per g TS），而菊芋粗提液產酸量僅為8.21g/l，檸檬酸產率為0.17（g per g TS），說明基因工程菌株Y. lipolytica30利用經過Ca(OH)2處理的菊芋提取液產檸檬酸能力明顯提升。
　　通過搖瓶實驗對基因工程菌株Y. lipolytica30利用菊芋提取液進行檸檬酸發(fā)酵的產酸條件進行優(yōu)化。實驗結果表明，以菊芋提取

4、液為底物產檸檬酸不需要添加額外的(NH4)2SO4、KH2PO4、VB1和Mg2+，菊芋提取液作為底物的最適總糖濃度為80.0g/l，最適接種量為106cells/50ml。同時我們在10-l發(fā)酵罐基礎上對基因工程菌株Y. lipolytica30以菊粉底物發(fā)酵產檸檬酸條件進行優(yōu)化，得到最適發(fā)酵條件：通氣量5 l/min/l，轉速300rpm，溫度28℃，初始pH6。最后，基因工程菌株Y. lipolytica30在10-l發(fā)酵發(fā)酵罐中

5、利用菊芋提取液為發(fā)酵底物，在上述最適條件下，發(fā)酵336 h后，發(fā)酵液中的菌體含量達到7.7 g/l，檸檬酸產量最終達到68.3g/l，殘余總糖為9.16g/l，還原糖殘留量為2.14 g/l，88.5％的總糖被用于合成檸檬酸和細胞生長。
　　最后利用鈣鹽法從檸檬酸發(fā)酵液中提取得到檸檬酸，經過反復純化后得到檸檬酸晶體。利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography HPLC)分析，與檸