酶促細菌生物發(fā)光體系的建立及其在細菌總數(shù)檢測方面的應(yīng)用.pdf

1、細菌總數(shù)是食品質(zhì)量控制的重要指標(biāo),對食品及其加工環(huán)境的監(jiān)測有重要的意義,在食品衛(wèi)生安全以及疾病防控中扮演著重要的角色。準(zhǔn)確、快速、靈敏的細菌總數(shù)檢測技術(shù)的研究與開發(fā)是食品安全檢測研究的熱點方向。
　　細菌熒光素酶生物發(fā)光體系是基于細菌胞內(nèi)NADH含量恒定且細菌數(shù)量與NADH含量有很好的相關(guān)性而建立的,通過對NADH的定量檢測可達到檢測細菌數(shù)量的目的。本實驗室已將該方法應(yīng)用于大腸桿菌、克雷伯氏菌、副溶血弧菌的檢測,但是由于胞內(nèi)NAD

2、H的低水平含量,檢測限局限于107 cfu/mL左右,不能滿足許多高靈敏檢測的要求,因而補充適宜的發(fā)光底物,最大限度地提高檢測靈敏度是亟需解決的問題。本論文根據(jù)細菌熒光素酶生物發(fā)光體系的發(fā)光強度與其必需底物NAD(P)H的良好相關(guān)性,借助外源酶促反應(yīng)將氧化型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)化為還原型吡啶核苷酸,提高生物發(fā)光方法檢測靈敏度,達到定量檢測細菌數(shù)量的目的;此外胞內(nèi)低水平的ATP通過擴增反應(yīng)實現(xiàn)對數(shù)增長并轉(zhuǎn)化為NADH,借助細菌生物發(fā)光方法達到定性

3、檢測細菌數(shù)量的目的。
　　第一:根據(jù)酶促反應(yīng)可實現(xiàn)吡啶核苷酸之間相互轉(zhuǎn)化的原理,通過對酶促反應(yīng)條件優(yōu)化,建立了乙醇脫氫酶體系、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶體系、乳酸脫氫酶體系、谷胱甘肽還原酶體系。四種體系可以實現(xiàn)NAD+與NADH、NADP+與 NADPH之間最大程度轉(zhuǎn)化,為酶促細菌生物發(fā)光法應(yīng)用于細菌總數(shù)的檢測奠定基礎(chǔ)。
　　第二:應(yīng)用細菌生物發(fā)光反應(yīng)與NAD(P)+還原反應(yīng)結(jié)合定量檢測細菌總數(shù)。根據(jù)胞內(nèi)氧化型吡啶核苷酸(NAD

4、+、NADP+)可以分別通過乙醇脫氫酶體系、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶體系轉(zhuǎn)化成還原型吡啶核苷酸(NADH、NADPH),從而實現(xiàn)信號的放大,達到提高靈敏度的目的。以四種吡啶核苷酸含量為媒介,細菌生物發(fā)光強度與細菌總數(shù)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.98),檢測限可達到1.05×105 cfu/mL,與之前發(fā)光體系相比靈敏度提高100倍。
　　第三:應(yīng)用細菌生物發(fā)光反應(yīng)與ATP擴增反應(yīng)結(jié)合定性檢測細菌總數(shù)。胞內(nèi)低濃度的ATP借助擴增反應(yīng)可