CHU_1798在Cytophaga hutchinsonii的滑動(dòng)和纖維素降解中的作用.pdf

1、Cytophagahutchinsonii是一種具有極強(qiáng)降解結(jié)晶纖維素能力的纖維素降解細(xì)菌，其在自然界中廣泛存在。C.hutchinsonii不依賴于鞭毛或纖毛卻能在玻璃表面迅速運(yùn)動(dòng)，其運(yùn)動(dòng)機(jī)制一直是未解之迷。C.hutchinsonii不分泌游離的纖維素酶也沒有纖維小體結(jié)構(gòu)，卻能夠高效的降解結(jié)晶纖維素，其降解機(jī)制也不清楚。C.hutchisonii降解結(jié)晶纖維素時(shí)，菌體有序的排列在纖維素纖維上，因此，研究者認(rèn)為C.hutchinson

2、ii的運(yùn)動(dòng)有助于纖維素的降解。通過對(duì)纖維素降解情況的研究，會(huì)促進(jìn)纖維素生物質(zhì)資源的開發(fā)利用。近幾年，實(shí)驗(yàn)室的遺傳操作體系已經(jīng)基本建立起來，C.hutchinsoii的相關(guān)研究工作已進(jìn)入到分子水平。本文通過轉(zhuǎn)座子Tn4351插入突變，尋找影響C.hutchinsoii纖維素降解及滑動(dòng)的基因，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的影響C.hutchinsoii滑動(dòng)的基因CHU_1798進(jìn)行了功能研究，并以此滑動(dòng)缺陷菌株，對(duì)C.hutchinsoii滑動(dòng)與纖維素降解之間

3、的關(guān)系進(jìn)行了研究。具體內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.轉(zhuǎn)座子Tn4351突變子文庫的構(gòu)建及滑動(dòng)相關(guān)基因的篩選
　　通過轉(zhuǎn)座子Tn4351構(gòu)建C.hutchinsonii突變子文庫，并依據(jù)滑動(dòng)性及纖維素降解能力變化等表型對(duì)700株突變子進(jìn)行篩選，篩選到三株運(yùn)動(dòng)能力完全缺失的突變株，通過反向PCR確定了轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)，CHU_1798,CHU3693，CHU_3620，并對(duì)CHU_1798及CHU_3693兩個(gè)基因進(jìn)行了敲除。

4、　　2.CHU_1798基因的功能研究
　　我們通過轉(zhuǎn)座子Tn4351插入突變以及基因敲除技術(shù)，確認(rèn)了影響C.hutchinsonii瓊脂表面菌落擴(kuò)散及單個(gè)菌體玻璃表面運(yùn)動(dòng)的基因CHU_1798。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，CHU_1798編碼一個(gè)未知功能蛋白，C末端為一個(gè)未知功能的結(jié)構(gòu)域CHU_C。Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與CHU_1798序列相似性大于30％的三個(gè)同源蛋白都含有CHU_C結(jié)構(gòu)域，而且這三個(gè)蛋白都存在于擬桿菌中，分別是Cytop

5、hagaaurantiaca,Segetibacterkoreensis,NiastellakoreensisGR20-10，這三個(gè)菌株含有F.johnsoniae滑動(dòng)的大部分同源基因。因此，我們認(rèn)為，CHU_C結(jié)構(gòu)域的蛋白可能參與擬桿菌的運(yùn)動(dòng)。F.johnsoniae是研究細(xì)菌滑動(dòng)的模式菌株，至今已有19個(gè)滑動(dòng)相關(guān)基因被確定，C.hutchinsonii含有上述所有滑動(dòng)基因的同源基因，因此研究者認(rèn)為C.hutchinsonii與F.j

6、ohnsoniae可能具有相同的滑動(dòng)機(jī)制，然而在F.johnsoniae我們并沒有找到CHU_1798的同源蛋白，敲除掉F.johnsoniae中關(guān)鍵滑動(dòng)蛋白SprB的同源蛋白CHU_2225后，菌株并沒有失去滑動(dòng)能力，而且，C.hutchinsonii表面也未觀察到類似于F.johnsoniae菌體表面纖毛的結(jié)構(gòu)，因此，我們猜測(cè)，C.hutchinsonii可能存在一種新的滑動(dòng)機(jī)制。
　　CHU_1798敲除菌株不能在瓊脂表面擴(kuò)

7、散運(yùn)動(dòng)，也失去了單個(gè)菌體玻璃表面運(yùn)動(dòng)的能力，CHU_1798敲除菌株仍能高效的降解濾紙，液體培養(yǎng)條件下也能高效的降解結(jié)晶纖維素AvicelPH101，然而，在纖維素雙層平板實(shí)驗(yàn)中，CHU_1798敲除菌株卻不能降解纖維素，以上結(jié)果表明:運(yùn)動(dòng)能夠有效的幫助C.hutchinsonii接觸纖維素底物，但是只要菌體在接觸到纖維素的條件下，滑動(dòng)對(duì)纖維素的降解是沒有幫助的。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌體在接種初期，敲除株在纖維表面的排列是無序的，然而當(dāng)菌