Cytophaga hutchinsonii纖維素降解關(guān)鍵基因和高效啟動(dòng)子序列的篩選鑒定.pdf

1、纖維素作為植物生物質(zhì)的主要構(gòu)成成分，是極為重要的可再生資源，而在長期進(jìn)化過程中形成的抗降解屏障使其尚未得以有效利用。自然界中存在眾多可降解纖維素的微生物，其中好氧革蘭氏陰性細(xì)菌Cytophaga hutchinsonii具有高效的結(jié)晶纖維素降解能力，但其降解機(jī)制至今仍是未解之謎。
　　為了研究C.hutchinsonii獨(dú)特的纖維素降解機(jī)制，本論文主要從以下兩個(gè)方面進(jìn)行了研究工作:一方面通過正反向遺傳手段對基于生物學(xué)信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)

2、座誘變得到的基因進(jìn)行定點(diǎn)插入失活，檢測突變株纖維素的利用情況，來篩選鑒定C.hutchinsonii中參與纖維素降解利用的重要功能基因;另一方面通過檢測C.hutchinsonii內(nèi)源基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的能力，獲得可用于基因回補(bǔ)及蛋白表達(dá)的高效啟動(dòng)子序列，以進(jìn)一步完善其遺傳操作體系。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　一、構(gòu)建TonB依賴受體編碼基因chu_0089的插入失活突變株，發(fā)現(xiàn)突變株在纖維素利用上表現(xiàn)出顯著延遲，表明該

3、基因在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　我們通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，chu_0089在突變株T127（chu_1276插入失活菌株，纖維素利用缺陷）中相對于野生型菌株表現(xiàn)出特異性下調(diào)。Chu_0089注釋為外膜通道蛋白TonB依賴受體的編碼基因。為了研究chu_0089在纖維素降解中的作用，我們對chu_0089進(jìn)行了定點(diǎn)插入失活。生長檢測發(fā)現(xiàn)突變株在葡萄糖上的生長沒有受到影響，而在纖維素和纖維二糖的生長上均表現(xiàn)出明顯的延遲

4、現(xiàn)象。Chu_0089的回補(bǔ)能夠恢復(fù)突變株的纖維素利用能力，證明突變株的纖維素利用延遲是由chu_0089的特異性插入失活導(dǎo)致，chu_0089在菌株纖維素利用中發(fā)揮著重要作用。
　　二、通過轉(zhuǎn)座誘變篩選鑒定到兩個(gè)可能與甲硫氨酸合成相關(guān)的基因chu_0694和chu_1812，它們在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　利用轉(zhuǎn)座子pHimarEM1誘變，篩選到兩株纖維素利用缺陷菌株T950和T964，質(zhì)粒拯救發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入

5、位點(diǎn)分別是chu_0694和chu_1812。通過Southernblot驗(yàn)證，轉(zhuǎn)座突變株中的轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)是專一性的。這兩個(gè)基因分別注釋為2-酮-4-丁酸甲硫酯轉(zhuǎn)氨酶(2-keto-4-methylthiobutyrate aminotransferase)和O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)的編碼基因，推測在甲硫氨酸的循環(huán)再生途徑及從頭合成途徑中發(fā)揮著作用。我們分別構(gòu)建了ch

6、u_0694和chu_1812的定點(diǎn)插入失活突變株，突變株表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)座誘變突變株相同的纖維素利用缺陷表型，表明這兩個(gè)基因在纖維素利用中發(fā)揮著重要作用，其在甲硫氨酸合成及纖維素降解中的具體作用機(jī)制需要今后進(jìn)一步探討研究。三、通過檢測C.hutchinsonii中不同內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)chu_2750的啟動(dòng)子可有效啟動(dòng)基因在C.hutchinsonii中的表達(dá)。
　　通過轉(zhuǎn)錄組分析及文獻(xiàn)報(bào)道，我們在C.hutchi

7、nsonii中選取了15個(gè)可能的高水平表達(dá)基因的啟動(dòng)子，以GFP（綠色熒光蛋白）為報(bào)告基因檢測了它們的表達(dá)啟動(dòng)能力。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，chu_2750的啟動(dòng)子能夠成功啟動(dòng)GFP的表達(dá)，而其它14個(gè)基因的啟動(dòng)子不能實(shí)現(xiàn)表達(dá);當(dāng)以LacZ（β-半乳糖苷酶基因z）為報(bào)告基因時(shí)，選取的chu_2750及其它3個(gè)基因的啟動(dòng)子均可啟動(dòng)LacZ的表達(dá)，但是以chu_2750啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力最高。我們利用chu_2750的啟動(dòng)子成功地實(shí)現(xiàn)了chu_0089