Cytophaga hutchinsonii纖維素降解相關(guān)基因的鑒定與功能研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，石油、煤炭等非可再生資源逐漸枯竭，人們所面臨的能源危機和環(huán)境污染問題越來越嚴(yán)重，因此開發(fā)利用清潔、環(huán)境友好型能源已經(jīng)成為人們的迫切需求。以纖維素為主要成分的植物生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，人們對于纖維素的開發(fā)利用越來越受到重視，但是由于纖維素結(jié)構(gòu)致密且存在結(jié)晶區(qū)使其不容易被酶解，纖維素的有效利用還存在很多障礙，因此闡明自然界中高效的纖維素降解機制，提高結(jié)晶纖維素的降解效率是木質(zhì)纖維素利用的關(guān)鍵。
　　自然

2、界中存在多種降解纖維素的微生物，它們采取不同的策略和機制對纖維素進行有效降解。好氧的哈氏噬纖維細菌（Cytophagahutchinsonii）廣泛分布于自然界中，能夠高效、快速、徹底的降解結(jié)晶纖維素。C.hutchinsonii既不像真菌一樣分泌游離的纖維素酶系，也不含有厭氧細菌的纖維小體，暗示著其采取了一種新型的纖維素降解策略，以實現(xiàn)對纖維素的有效降解。因此，對C.hutchinsonii纖維素降解機制的研究和闡明能夠豐富和提高人們

3、對于纖維素降解機理的認識，促進纖維素的開發(fā)和利用。
　　本文以C.hutchinsonii為研究對象，對其與纖維素降解相關(guān)基因進行鑒定和功能研究。一方面通過轉(zhuǎn)座子隨機插入構(gòu)建突變體庫的方法篩選獲得纖維素利用缺陷突變株。我們獲得了一株纖維素利用缺陷突變株MT1-5，并對其插入失活的基因進行了鑒定和功能研究。另一方面，對可能與纖維素降解相關(guān)的基因cbp1(chu_3654)和oppA(chu_3498)進行單插入失活，研究它們的失活對

4、菌株利用纖維素能力的影響。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.C.hutchinsonii纖維素利用缺陷突變株MT1-5的篩選與鑒定通過將轉(zhuǎn)座子pHimarEm1隨機插入到野生型菌株基因組中，得到大量的突變株，經(jīng)過篩選，我們獲得一株不能以纖維素和濾紙分別為唯一碳源生長的缺陷突變株MT1-5。經(jīng)鑒定突變株MT1-5中基因chu2981被插入失活?；騝hu2981的開放閱讀框含有393個核苷酸，編碼蛋白僅由130個氨基酸組成，將其命名

5、為Spp1。序列分析表明Spp1是一個未知功能的保守蛋白。
　　2.C.hutchinsonii纖維素降解相關(guān)基因spp1(chu_2981)基因功能的研究篩選到的突變株MT1-5在以葡萄糖、纖維二糖分別為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，與野生型菌株生長狀況無明顯差異，但在以纖維素作為唯一碳源的培養(yǎng)基中喪失了生長能力。MT1-5中參與纖維素吸附的外膜蛋白的種類和數(shù)量也極大降低。此外，MT1-5在瓊脂平板上的擴散能力和在玻璃表面的運動能力

6、也明顯下降。對突變株進行基因回補，回補菌株能夠恢復(fù)纖維素利用能力、在瓊脂平板上的擴散能力和液體中的運動能力。上述結(jié)果表明，突變株MT1-5中缺失的Spp1蛋白在菌株利用纖維素和擴散、運動過程中發(fā)揮著極其重要的作用。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)Spp1定位于細胞的周質(zhì)空間，其功能和作用機制需要進一步研究。
　　3.周質(zhì)空間蛋白Spp1的異源表達、純化及功能研究
　　在大腸桿菌中對Spp1進行異源表達和純化，得到N端帶有GST

7、標(biāo)簽的重組蛋白GST-Spp1。在體外添加重組蛋白GST-Spp1不能恢復(fù)突變體對纖維素的利用。采用“GSTpull-down”方法沒有釣取到C.hutchinsonii中與GST-Spp1相互作用的蛋白。檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白GST-Spp1在緩沖液中是以單體形式存在的。
　　4.C.hutchinsonii可能的纖維素降解相關(guān)基因cbp1(chu_3654)和oppA(chu_3498)的插入失活及功能研究
　　對編碼可能的纖

8、維素吸附蛋白的基因cbp1(chu_3654)和可能的纖維二糖結(jié)合蛋白的基因oppA(chu_3498)進行單插入失活。Cbp1的失活導(dǎo)致菌株吸附纖維素的外膜蛋白的總量降低，但并未顯著影響菌體的纖維素利用能力和菌體對纖維素的吸附能力。OppA的失活導(dǎo)致菌株的纖維二糖利用能力受到較大影響，但也未顯著影響菌體對于纖維素的利用能力。上述結(jié)果表明，Cbp1和OppA的缺失對Cytophagahutchinsonii的纖維素利用能力均并未有顯著影