Cytophaga hutchinsonii纖維素降解及滑動(dòng)相關(guān)基因的研究.pdf

1、進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，能源危機(jī)、環(huán)境污染的問(wèn)題越來(lái)越突出，影響到了人類的健康生存和可持續(xù)發(fā)展。發(fā)展可持續(xù)的、綠色能源來(lái)代替石油、煤炭等化石資源已經(jīng)成為人們迫切的需求。以木質(zhì)纖維素為主要成分的植物生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，對(duì)木質(zhì)纖維素的開發(fā)利用越來(lái)越受到人們的重視。由于纖維素自身結(jié)構(gòu)致密，并存在結(jié)晶區(qū)，不容易被酶解，使得現(xiàn)有的纖維素生物轉(zhuǎn)化效率低，成本高。因此揭示自然界中高效的纖維素降解機(jī)制，提高結(jié)晶纖維素的降解效率是木質(zhì)纖維素利用的

2、關(guān)鍵。
　　 Cytophaga hutchinsonii是一種自然界中廣泛分布的纖維素降解細(xì)菌，具有極強(qiáng)的結(jié)晶纖維素降解能力。C.hutchinsonii不分泌游離的纖維素酶也沒(méi)有纖維小體結(jié)構(gòu)，表明其具有不同于已知的好氧真菌或厭氧細(xì)菌的獨(dú)特的結(jié)晶纖維素降解機(jī)制。此外，C.hutchinsonii的不依賴于鞭毛或纖毛的滑動(dòng)機(jī)制也是未解之謎。C.hutchinsonii降解纖維素時(shí)，菌體有序地排列在纖維素纖維上，研究者猜測(cè)C.hu

3、tchinsonii的滑動(dòng)與纖維素降解有關(guān)。對(duì)C.hutchinsonii新型結(jié)晶纖維素降解機(jī)制的研究能夠豐富人們對(duì)微生物纖維素降解策略的認(rèn)識(shí)，并有助于對(duì)現(xiàn)有纖維素降解酶系的改進(jìn)和提高，促進(jìn)纖維素資源的開發(fā)利用。之前由于缺少成熟的遺傳操作體系，對(duì)C.hutchinsonii纖維素降解與滑動(dòng)的研究進(jìn)展十分緩慢。近幾年我們實(shí)驗(yàn)室初步建立C.hutchinsonii的部分遺傳操作技術(shù)，為纖維素降解及滑動(dòng)機(jī)制的研究深入到分子水平奠定了基礎(chǔ)。本文

4、首次建立了Himar轉(zhuǎn)座子的插入突變和基因回補(bǔ)技術(shù)，為基因功能的研究創(chuàng)造了條件。利用這些技術(shù)首次篩選到多個(gè)參與C.hutchinsonii纖維素降解與滑動(dòng)的關(guān)鍵基因，并分別對(duì)其基因功能進(jìn)行了深入研究。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了C.hutchinsonii存在細(xì)胞表面的纖維素利用途徑，并對(duì)菌體運(yùn)動(dòng)與纖維素降解之間的關(guān)系進(jìn)行了探討。這些研究工作對(duì)揭示C.hutchinsonii獨(dú)特的纖維素降解和滑動(dòng)機(jī)制有著重要意義。具體內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　

5、 1.Himar轉(zhuǎn)座子插入突變和基因回補(bǔ)技術(shù)的建立：
　　 轉(zhuǎn)座子插入突變是研究基因功能的有效手段。我們嘗試了兩種轉(zhuǎn)座子Tn4351和HimarEm3對(duì)Chutchinsonii的轉(zhuǎn)座插入突變，轉(zhuǎn)座子HimarEm3改造自HimarEM1。發(fā)現(xiàn)在接合平板中加入20μg/ml的Km可以將接合轉(zhuǎn)化效率提高一倍，通過(guò)優(yōu)化接合轉(zhuǎn)化條件，兩種轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到3.0×10-7和1.2×10-6。對(duì)Tn4351在F.johnsoniae

6、中的轉(zhuǎn)座插入研究發(fā)現(xiàn)其插入形式比較復(fù)雜多樣。我們通過(guò)Southern blot分析了HimarEm3在C.hutchinsonii中的插入情況，發(fā)現(xiàn)其大多情況下是單插入形式，這表明HimarEm3是很好的插入失活研究基因功能的工具。
　　 紅霉素是已知的在C.hutchinsonii中唯一可用的抗生素篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記的缺少限制了C.hutchinsonii中的遺傳操作。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)頭孢西丁抗性基因（cfxA）和四環(huán)素抗性基因（

7、tetQ）能夠在C.hutchinsonii中表達(dá)。以此為篩選標(biāo)記構(gòu)建了可用于回補(bǔ)轉(zhuǎn)座子Tn4351和HimarEm3的插入突變的質(zhì)粒載體，為轉(zhuǎn)座插入研究基因功能創(chuàng)造了條件。
　　 2.CHU_0134基因功能研究：
　　 菌體對(duì)纖維素的吸附是其酶解的第一步，序列分析發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii編碼的纖維素酶大都不含CBM，菌體與纖維素直接接觸是纖維素降解所必需的。我們通過(guò)轉(zhuǎn)座子HimarEm3的插入突變篩選到一株菌

8、體對(duì)纖維素的吸附率只有野生菌株一半的突變株A-4。表型測(cè)定發(fā)現(xiàn)A-4不能降解纖維素并表現(xiàn)出瓊脂表面菌落擴(kuò)散缺陷。纖維素酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)突變株細(xì)胞表面及胞外的內(nèi)切纖維素酶酶活下降40％。纖維素吸附外膜蛋白的SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，突變株中大部分的纖維素吸附外膜蛋白含量降低或消失。質(zhì)譜鑒定差異蛋白條帶為一些Gld蛋白(CHU_0171、0173、0174、3494)和一些未知功能蛋白(CHU_3654、1277、3655)。這些蛋白可能在C.

9、hutchinsonii的纖維素吸附、降解中起重要作用。
　　 Southern blot與反向PCR確定A-4中HimarEm3的插入基因?yàn)镃HU_0134。回補(bǔ)基因CHU_0134使突變株的纖維素吸附、降解及瓊脂表面的菌落擴(kuò)散表型恢復(fù)。研究結(jié)果表明CHU_0134能夠影響C.hutchinsonii菌體的纖維素吸附、降解以及在瓊脂表面的菌落擴(kuò)散。序列分析預(yù)測(cè)CHU_0134編碼一個(gè)硫醇-二硫化物異構(gòu)酶，在C-端有包含C-G-

10、H-G的類T(l)pA結(jié)構(gòu)。硫醇-二硫化物異構(gòu)酶可以催化蛋白質(zhì)中二硫鍵的異構(gòu)作用，對(duì)于很多細(xì)胞質(zhì)以外的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及穩(wěn)定性是非常重要的。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)擬桿菌中有很多蛋白與CHU_0134有較高的序列相似性，而且大都含有保守的C-G-H-C序列，這類蛋白的功能值得研究。
　　 3.CHU_1277基因功能研究：
　　 CHU_1277編碼一個(gè)纖維素吸附外膜蛋白，我們通過(guò)基因的定點(diǎn)插入失活構(gòu)建了CHU_1277失活突變株(△

11、1277)，纖維素吸附外膜蛋白中CHU_1277蛋白條帶缺失證明CHU_1277被失活。RT-PCR顯示△1277中CHU_1277的臨近基因的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有受到影響?！?277表現(xiàn)出纖維素利用缺陷以及纖維寡糖利用能力的降低，說(shuō)明CHU_1277是影響C.hutchinsonii纖維素類底物利用的關(guān)鍵基因。
　　 △1277的內(nèi)切纖維素酶酶活與野生菌株相比沒(méi)有明顯變化，菌體表面β-葡萄糖苷酶酶活下降30％。HPLC分析菌體對(duì)纖維二糖的

12、水解發(fā)現(xiàn)△1277菌體的纖維二糖水解能力明顯低于野生菌株，與△1277利用纖維二糖的生長(zhǎng)很弱相吻合。然而提取的△1277的外膜蛋白卻表現(xiàn)出與野生菌株相似的β-葡萄糖苷酶酶活和纖維二糖水解能力。這表明突變株細(xì)胞表面的β-葡萄糖苷酶并沒(méi)有減少，只是活力沒(méi)有充分展現(xiàn)出來(lái)。細(xì)胞表面蛋白CHU_1277對(duì)位于細(xì)胞表面的β-葡萄糖苷酶的酶活充分發(fā)揮可能是必需的。
　　 提取的突變株的外膜蛋白有著與野生菌株基本相同的纖維素酶酶活以及纖維素水解

13、能力，表明突變株外膜蛋白中的纖維素酶的量與野生菌株基本相同，纖維素酶并不是導(dǎo)致突變株纖維素降解缺陷的主要原因。這暗示著只有纖維素酶對(duì)C.hutchinsonii的纖維素降解還是不夠的，某些非酶蛋白的參與是纖維素降解所必需的。CHU_1277是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)影響C.hutchinsonii纖維素降解的表面蛋白。深入探索CHU_1277如何影響C.hutchinsonii的纖維素降解將對(duì)闡明其獨(dú)特的纖維素降解機(jī)制有著重要意義。
　　

14、4.C.hutchinsonii對(duì)纖維二糖的利用：
　　 纖維二糖是已知的C.hutchinsonii可以利用的少數(shù)幾種寡糖之一，又是纖維素降解中的重要中間產(chǎn)物。我們首次研究了C.hutchinsonii對(duì)纖維二糖的利用方式。雖然基因組序列分析預(yù)測(cè)可能的β-葡萄糖苷酶都位于細(xì)胞周質(zhì)，但是多次酶活實(shí)驗(yàn)表明大部分的β-葡萄糖苷酶活力位于細(xì)胞表面。菌體對(duì)纖維二糖的水解實(shí)驗(yàn)也表明C.hutchinsonii的細(xì)胞表面有很強(qiáng)的纖維二糖水解

15、能力，目前正在對(duì)細(xì)胞表面的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行研究。
　　 HPLC分析C.hutchinsonii在纖維二糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)基中的糖分變化發(fā)現(xiàn)，接種之后，培養(yǎng)基中的纖維二糖就被逐漸水解，葡萄糖逐漸積累，在C.hutchinsonii達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期之前，培養(yǎng)基中的纖維二糖已經(jīng)基本被完全水解，積累了很高濃度的葡萄糖，葡萄糖成為支持細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期之后繼續(xù)生長(zhǎng)的唯一碳源。這表明通過(guò)細(xì)胞表面的β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖再吸

16、收利用是C.hutchinsonii利用纖維二糖的主要途徑。
　　 5.C.hutchinsonii細(xì)胞表面的纖維素降解：
　　 HPLC分析菌體對(duì)纖維素的水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)一部分的纖維素可以在C.hutchinsonii的細(xì)胞表面被降解。通過(guò)加入葡萄糖酸內(nèi)酯抑制β-葡萄糖苷酶酶活以及加入NaN3抑制細(xì)胞的呼吸產(chǎn)能，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的纖維素降解是先由內(nèi)切纖維素酶將纖維素水解為纖維寡糖（纖維二糖、三糖、四糖），然后再由β-葡萄糖苷酶

17、將纖維寡糖水解為葡萄糖。提取的C.hutchinsonii的外膜蛋白中有內(nèi)切纖維素酶酶活和β-葡萄糖苷酶酶活，能夠在體外水解纖維素，葡萄糖是唯一產(chǎn)物，說(shuō)明纖維素在外膜蛋白中的內(nèi)切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的共同作用下能夠被水解為葡萄糖，這也支持纖維素細(xì)胞表面降解。
　　 纖維素細(xì)胞表面降解不符合Wilson提出C.hutchinsonii的纖維素降解模型，模型中預(yù)測(cè)纖維素鏈從纖維素上被剝離下來(lái)，然后運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)中進(jìn)一步被內(nèi)切纖維素

18、酶降解。在我們的實(shí)驗(yàn)中，在胞外只檢測(cè)到很少量的纖維寡糖產(chǎn)物，因此尚不能確定纖維素的細(xì)胞表面降解是C.hutchinsonii利用纖維素的主要方式。但是在C.hutchinsonii的細(xì)胞表面的確存在纖維素降解過(guò)程，并且降解產(chǎn)物可以被菌體吸收。而C.hutchinsonii是以何種形式吸收纖維素水解產(chǎn)物的還有待進(jìn)一步的研究。
　　 6.CHU_1797基因功能研究：
　　 我們通過(guò)轉(zhuǎn)座子HimarEm3的插入突變以及基因回

19、補(bǔ)確證了一個(gè)新的影響C.hutchinsonii在瓊脂表面菌落擴(kuò)散的基因，CHU_1797。序列分析預(yù)測(cè)CHU_1797編碼一個(gè)包含未知功能結(jié)構(gòu)域DUF3308的外膜蛋白。比對(duì)發(fā)現(xiàn)與CHU_1797有序列相似性的蛋白廣泛分布于擬桿菌中，大都含有未知功能結(jié)構(gòu)域DUF3308，預(yù)測(cè)大都定位在膜上。這類膜蛋白可能與菌體的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。
　　 CHU_1797失活突變株在瓊脂表面的菌落擴(kuò)散出現(xiàn)缺陷，進(jìn)一步影響了菌體在瓊脂表面

20、趨向葡萄糖的運(yùn)動(dòng)以及與埋在瓊脂中的纖維素底物的接觸。但是CHU_1797的失活并不影響單個(gè)菌體在玻璃表面上的滑動(dòng)，突變株對(duì)纖維素的降解能力也沒(méi)有明顯變化。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變株菌體在纖維素纖維上排列有序，與野生菌株的現(xiàn)象相同。這說(shuō)明C.hutchinsonii在瓊脂表面的菌落擴(kuò)散能力不是菌體在玻璃表面的個(gè)體運(yùn)動(dòng)以及纖維素降解所必需的。C.hutchinsonii在瓊脂表面的菌落擴(kuò)散與在玻璃表面的個(gè)體運(yùn)動(dòng)是兩種不同的運(yùn)動(dòng)形式，存在著不同