Cytophaga hutchinsonii遺傳操作體系的構(gòu)建及纖維素利用缺陷菌的篩選與鑒定.pdf

1、當今社會，能源和環(huán)境是全世界、全人類共同關心的問題，也是我國社會經(jīng)濟發(fā)展的重要問題。然而隨著石油、煤炭等非可再生資源的逐漸枯竭，開發(fā)新的可再生能源已經(jīng)成為人們迫切的需求。纖維素類能源植物是頗具前景的生物質(zhì)原料，這類植物多為多年生植物，生長迅速、生物質(zhì)產(chǎn)量大且適應能力強，但是纖維素的酶解效率低使得纖維素類生物質(zhì)能源走出實驗室，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化目標存在許多障礙。隨著多種纖維素降解微生物及其酶類的發(fā)現(xiàn)，人們對纖維素降解機理有了更加理性的認識，為實現(xiàn)

2、廉價高效開發(fā)生物質(zhì)資源奠定了理論基礎。
　　 Cytophaga hutchinsonii廣泛存在于自然界中，它對結(jié)晶纖維素降解速度快，分解能力強，因此，對其纖維素降解機制的闡明，將對人們深入了解微生物降解纖維素機制的多樣性有重要的理論意義。自從1938年Walker和Warren分離C.hutchinsonii以來，對該菌纖維素降解機理的研究只停留在生理生化水平上，并未有太多相關的報道。限制該菌研究的主要因素主要有兩方面:第一

3、，對該菌纖維素降解相關酶的異源表達存在很大難度;第二，缺乏成熟且穩(wěn)定的遺傳操作系統(tǒng)。本論文以C.hutchinsonii為研究對象，建立完善了以電轉(zhuǎn)化為基礎的遺傳操作體系，并利用轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)獲得了一株纖維素利用缺陷突變株，進一步鑒定了所插入失活的基因座位;通過熒光定量PCR方法，分析了其纖維素酶在不同碳源下的表達情況，具體工作內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　 1.C.hutchinsonii生長狀態(tài)的研究及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

4、>　　 對C.hutchinsonii進行培養(yǎng)主要有PYG培養(yǎng)基和無機鹽培養(yǎng)基，通過調(diào)節(jié)其中的碳源和氮源比例使其生長到穩(wěn)定期時的OD600值達到原來培養(yǎng)基培養(yǎng)時的2-5倍，從而為遺傳轉(zhuǎn)化的進行奠定了基礎。C.hutchinsonii的遺傳操作體系尚未成熟，遺傳轉(zhuǎn)化是限制其遺傳操作的關鍵因素，制約著C.hutchinsonii對外源基因的整合、基因功能鑒定和代謝機制的研究。本研究中探索了多種遺傳轉(zhuǎn)化方法，最終確定以電轉(zhuǎn)化方法將外源基因轉(zhuǎn)

5、入C.hutchinsonii中的轉(zhuǎn)化途徑和方法，并確定了電轉(zhuǎn)化的最佳條件，轉(zhuǎn)化效率可達1×103-104colonies/μgDNA。
　　 2.C.hutchinsonii中纖維素酶在不同碳源培養(yǎng)條件下表達情況存在差異。
　　 C.hutchinsonii中有多個被注釋為與纖維素降解相關的基因，通過在轉(zhuǎn)錄水平上分析它們在不同底物下的表達情況，從而推斷其與纖維素降解的關系。結(jié)合反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和熒光定量PC

6、R技術(shù)對其中10個纖維素酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達情況進行研究，發(fā)現(xiàn)chu-1107，chu-1280，chu-1335，chu-1655，chu-2268這五個基因可以被纖維素誘導表達，且它們的誘導表達模式不同，為以后用生化方法研究纖維素酶誘導表達模式奠定了基礎。
　　 3.通過轉(zhuǎn)座子pHimarEM1隨機誘變C.hutchinsonii篩選獲得一株纖維素利用缺陷的突變株。
　　 利用轉(zhuǎn)座子pHimarEM1誘變篩選不能

7、利用纖維素作為碳源進行生長的隨機突變株。經(jīng)過篩選，得到了一株纖維素利用缺陷的菌株，命名為C-34菌株。通過質(zhì)粒拯救并測序的方法確定轉(zhuǎn)座子插入位置為基因座位chu-1278。C-34菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，與野生型菌株生長狀況差異不大，但是在以纖維素作為碳源的培養(yǎng)基中有明顯的生長缺陷。對突變株進行基因回補實驗后恢復野生型表型，說明基因chu-1278在C.hutchinsonii降解纖維素過程中有重要作用。
　　 4

8、.C.hutchinsonii中滑動相關基因的研究及基因敲除方法的探索。
　　 C.hutchinsonii可以在固體介質(zhì)表面滑動，其滑動性與纖維素降解之間可能有重要聯(lián)系。C.hutchinsonii的運動機制尚不明確，我們將C.hutchinsonii中可能與其滑動相關的基因進行了整理，并試圖用單插入失活，同源雙交換敲除，Cre-loxP等方法對其中部分基因進行敲除，但沒有得到預期的突變株。在此過程中多個載體的構(gòu)建和敲除方法的