基于蛋白和核酸的副溶血弧菌鑒定與分型研究.pdf

1、目的：1.利用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（Multilocus sequence typing, MLST）研究我國(guó)遼寧、浙江和廣州地區(qū)的副溶血弧菌型別分布，比較3個(gè)地區(qū)的型別分布差異，分析其種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化趨勢(shì)及流行特性；2.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS

2、)構(gòu)建副溶血弧菌質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，增加數(shù)據(jù)庫(kù)中副溶血弧菌圖譜的多樣性，提高其鑒定準(zhǔn)確率，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；3.比較基于核酸的多位點(diǎn)序列分型技術(shù)和基于蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果，擬從核酸和蛋白2個(gè)層面闡釋副溶血弧菌的進(jìn)化流行趨勢(shì)。
　　方法：1. PCR擴(kuò)增副溶血弧菌7個(gè)管家基因，根據(jù)7個(gè)管家基因的核酸序列信息獲得其等位基因型（allele）以及序列型（Sequence Type, ST）；2. DnaSP5.0以及eBUR

3、ST Version3.0分析序列多樣性，SplitsTree4、 STRUCTURE等軟件分析副溶血弧菌種群結(jié)構(gòu)特征；3.利用MALDI-TOF MS技術(shù)構(gòu)建副溶血弧菌質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，增加數(shù)據(jù)庫(kù)中副溶血弧菌參考圖譜信息；4.應(yīng)用Biotyper軟件對(duì)質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，從蛋白水平闡述副溶血弧菌的聚類關(guān)系。
　　結(jié)果：1.遼寧、浙江和廣州地區(qū)307株副溶血弧菌共160個(gè)序列型，其中117個(gè)為新序列型。遼寧地區(qū)57株副溶血弧菌

4、共47個(gè)序列型，新序列型24個(gè)，浙江地區(qū)152株副溶血弧菌共36個(gè)序列型，其中新序列型23個(gè)，廣州地區(qū)97株副溶血弧菌共78個(gè)序列型，其中71個(gè)為新序列型；2.副溶血弧菌在3個(gè)地區(qū)內(nèi)部及3個(gè)地區(qū)間均存在顯著的重組現(xiàn)象。SplitsTree4種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，160個(gè)序列型共分成2個(gè)分支，STRUCTURE種群結(jié)構(gòu)分析將160個(gè)序列型分為3個(gè)亞群；3.共構(gòu)建334株副溶血弧菌質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，包括臨床株和環(huán)境株，增加了數(shù)據(jù)庫(kù)中參考圖譜多

5、樣性；4. MALDI-TOF MS聚類分析結(jié)果顯示，遼寧地區(qū)和廣州地區(qū)副溶血弧菌蛋白圖譜峰聚集在一個(gè)分支上，且與浙江菌株間存在一定的差異，但是仍有部分廣州菌株與浙江菌株聚集在同一個(gè)分支；5.比較基于核酸的序列分析結(jié)果與基于蛋白質(zhì)譜的聚類分析結(jié)果顯示，2種分析結(jié)果不存在明顯的聯(lián)系；6.利用MALDI-TOF MS對(duì)廣州地區(qū)臨床株與環(huán)境株進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示臨床株和環(huán)境株在質(zhì)譜聚類上不能完全區(qū)分；7.浙江地區(qū) O3:K6和 O4:K8血

6、清型MALDI-TOF MS聚類分析結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS在副溶血弧菌 O3:K6和O4:K8血清分型上具有潛在能力。
　　結(jié)論：1.307株副溶血弧菌MLST分析表明副溶血弧菌序列型具有高度多樣性，且7個(gè)等位基因也存在高度的多樣性。副溶血弧菌在3個(gè)地區(qū)內(nèi)部及3個(gè)地區(qū)間均存在顯著地重組現(xiàn)象；2.種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，307株副溶血弧菌共160個(gè)序列型大致分成2個(gè)亞群，其中一個(gè)亞群內(nèi)部有19個(gè)序列型相較于其他副溶血弧菌而