基于微流控技術(shù)的環(huán)境中金黃色葡萄球菌的檢測研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是環(huán)境微生物的一種，廣泛的存在于自然界中。少量的金黃色葡萄球菌不會對環(huán)境產(chǎn)生影響，是正常的生物群落組成部分之一。但當其所在的環(huán)境適合其生長時，金黃色葡萄球菌將會大量繁殖，對該環(huán)境造成污染，并通過空氣、水等介質(zhì)傳播，感染其中生物，導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生，嚴重威脅到該環(huán)境中的其他生物健康，引發(fā)多種疾病甚至導(dǎo)致死亡，造成大量的經(jīng)濟損失。金黃色葡萄球菌很容易隨著水體、空氣進入人體中大量繁殖，產(chǎn)生腸毒素。引起惡心、嘔吐、胃痙攣和腹瀉等中

2、毒癥狀，其中免疫力低下的人群如兒童和老年人其受感染，將會導(dǎo)致感染性休克或多器官功能衰竭，嚴重的可能導(dǎo)致死亡。不僅如此，金黃色葡萄球菌在傳播污染過程中極容易發(fā)生變異產(chǎn)生耐藥基因，引發(fā)嚴重的生物安全問題。
　　因此，檢測金黃色葡萄球菌的濃度變化，對保障環(huán)境安全以及避免環(huán)境遭受大面積的金黃色葡萄球菌污染、保障人類健康、及時有效的進行生物安全的防控以及環(huán)境預(yù)警等，都具有重大意義。目前有很多學(xué)者對環(huán)境類樣本中的金黃色葡萄球菌進行研究、檢測，

3、但是所用的方法大多為培養(yǎng)法。金黃色葡萄球菌作為生物性污染物的一種，有著能夠在短時間內(nèi)自我生長、繁殖的特點。不同時間對同一份環(huán)境樣本中的金黃色葡萄球菌進行檢測，其結(jié)果數(shù)值有著巨大的差異。因此，對金黃色葡萄球菌進行快速在線實時分析的需求日益緊迫。
　　微流控技術(shù)是一種新興的技術(shù)，能夠?qū)⒍喾N反應(yīng)集成到一塊幾個平方厘米的芯片上完成，由于其效率高、成本低、分析時間短，并且能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、樣本結(jié)果一體化(Sample to answer)、便

4、攜化檢測，逐漸為了最佳的污染物檢測技術(shù)之一。
　　在本論文中，建立了兩類微流控體系，即分別為微流控—環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)檢測體系以及微流控—免疫檢測體系，均能夠?qū)瘘S色葡萄球菌進行高效、快速、準確、低成本的實時監(jiān)測。
　　在微流控—環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測體系的建立中，首先設(shè)計并篩選出了一套能夠針對金黃色葡萄球菌nuc基因進行擴增的引物，建立了一個

5、宏觀的金黃色葡萄球菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測體系，并用13種其他細菌作為陰性對照，對該體系的特異性進行驗證。然后將這個穩(wěn)定的、高特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增體系整合在了微流控芯片中。所形成的微流控—LAMP體系將樣品的處理、金黃色葡萄球菌DNA的釋放、擴增以及結(jié)果的觀察集成在了一個長寬均為厘米級別的芯片中，能夠在一個小時左右，同時完成對4個樣本檢測。在將宏觀狀態(tài)下的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增金黃色葡萄球菌檢測體系整合在微米級的管道中的同時，將整個反應(yīng)體系從25

6、μL縮小到了1.5μL，因此采用此體系進行檢測大大減少了對試劑量的需求，同時也相應(yīng)的減少了對樣本量的需求。本體系檢測限為10個DNA拷貝，比PCR反應(yīng)低12個數(shù)量級。反應(yīng)結(jié)果在365nm的紫外線下清晰可見。并且通過對芯片結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，使得芯片體系制作簡單、容易操作，可以整合在便攜式、自動化的系統(tǒng)中。在實際應(yīng)用中，可以實現(xiàn)直接在樣品采集地對樣本進行檢測，免去了樣本運送的麻煩。為驗證本體系的實用性和準確性，用此體系檢測了24例實際樣本，并與傳

7、統(tǒng)的培養(yǎng)法進行對比。采用本體系實時監(jiān)測金黃色葡萄球菌的濃度，可以有效的避免其對所在的環(huán)境造成大規(guī)模污染，對環(huán)境中的金黃色葡萄球菌的防治起到了積極作用，保障人類健康不受其威脅，應(yīng)用前景較為廣泛。為了適應(yīng)大量樣本的檢測，在本研究中對上述的微流控—環(huán)介導(dǎo)等溫擴增進行了進一步的優(yōu)化，優(yōu)化的體系可以同時檢測12個樣本。并且通過對芯片設(shè)計的優(yōu)化，使得操作更為簡單、方便。使用本體系對金黃色葡萄球菌進行檢測，降低了檢測成本以及試劑需求量，大大簡化了制作

8、過程以及操作過程，可以整合在便攜式、自動化的系統(tǒng)中
　　本論文還建立了一個微流控—免疫反應(yīng)體系，可以在同一個體系中同時完成對8個樣品的檢測，所需時間不超過40min，并且驗證了芯片的特異性。相對于宏觀的檢測方法，本體系大大降低了樣本的檢測成本以及檢測時間。并且將檢測系統(tǒng)優(yōu)化了以后，將能夠適用于在采樣現(xiàn)場的實時快速檢測。通過熒光強度的分析，可以定量的檢測樣本中金黃色葡萄球菌的濃度，進行簡單的環(huán)境學(xué)分析。通過利用本體系對實際樣本進行了

9、檢測，并用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法做對照，進一步驗證了該體系的可行性和穩(wěn)定性。該方法可以用于檢測養(yǎng)殖場廢水中金黃色葡萄球菌，為廢水處理方法的選擇提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。本系統(tǒng)通過對養(yǎng)殖業(yè)廢水中金黃色葡萄球菌的實時檢測，在控制其對環(huán)境中水體、土壤以及禽畜之間的污染起到了積極作用。
　　本論文中所建立的兩個體系，原理不同，方式不同，但是均可以快速、準確、實時的、特異性的檢測金黃色葡萄球菌。可以用兩種體系對同一樣本進行檢測，通過對比檢測結(jié)果，相互進行