食源“超級(jí)細(xì)菌”快速篩檢技術(shù)的構(gòu)建.pdf

1、目前，隨著進(jìn)出口貿(mào)易技術(shù)壁壘花樣的不斷翻新，發(fā)達(dá)國家很有可能將進(jìn)出口動(dòng)物源性食品及飼料中的耐藥致病菌設(shè)置為一種新的貿(mào)易技術(shù)壁壘，無論出于何種目的，耐藥致病菌將在食品安全問題和進(jìn)出口貿(mào)易上掀起一次大的波瀾，所以，很有必要進(jìn)行前瞻性的檢測(cè)技術(shù)研究和分子流行病學(xué)調(diào)查，從而為我國政府應(yīng)對(duì)國內(nèi)外食品安全的突發(fā)事件提供技術(shù)支持。
　　因在檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)日常的食品、農(nóng)產(chǎn)品微生物檢測(cè)中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是常規(guī)五項(xiàng)檢測(cè)中的必檢項(xiàng)目，所以本論文

2、選擇大腸桿菌和金黃色葡萄球菌這兩種致病菌做為研究對(duì)象，試圖建立一種快速篩檢技術(shù)，來判斷它們是否存在超級(jí)耐藥基因。
　　本論文的主要研究?jī)?nèi)容是利用大腸桿菌NDM-1基因和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因的序列特點(diǎn)，建立快速生化初篩技術(shù)和核酸層析膠體金快速檢測(cè)技術(shù)，并完成PCR-核酸層析膠體金快速檢測(cè)試劑條的研發(fā)，以滿足當(dāng)前口岸檢疫新形勢(shì)的需要。
　　1.對(duì)大腸桿菌NDM-1基因和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因的菌株（

3、為生物安全起見，實(shí)際為合成的帶有超級(jí)耐藥基因的質(zhì)粒）進(jìn)行分析，即兩種基因的合成與重組質(zhì)粒的構(gòu)建。然后，針對(duì)這兩種耐藥基因分別建立經(jīng)典的PCR檢測(cè)技術(shù)體系，利用經(jīng)典PCR技術(shù)對(duì)設(shè)計(jì)、合成的引物進(jìn)行驗(yàn)證，確定引物的特異性和靈敏度。
　　2.對(duì)大腸桿菌NDM-1基因、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因進(jìn)行基因排列，按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行全面的信息收集，尋找、篩查保守區(qū)間。對(duì)其中目的片段序列進(jìn)行比對(duì)分析，從中找出了滿足PCR-核酸層析膠體金的

4、特異性片段、特異性突變位點(diǎn)，建立PCR-核酸薄膜層析技術(shù)體系，并進(jìn)行特異性和靈敏度的驗(yàn)證。利用這一技術(shù)來檢測(cè)大腸桿菌的NDM-1基因和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的mecA基因，實(shí)現(xiàn)了提高超級(jí)耐藥基因NDM-1和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因檢測(cè)速度的目的，特異性良好，靈敏度分別為5.6×102cfu/ml和8.3×102cfu/ml。
　　3.利用建立的方法對(duì)山東省內(nèi)采集的樣品進(jìn)行分析評(píng)估，對(duì)設(shè)計(jì)的試劑條進(jìn)行評(píng)定、改進(jìn)。對(duì)使用

5、過抗生素類的以禽畜肉為主的食品中是否存在“超級(jí)細(xì)菌”的危害進(jìn)行了一次大規(guī)模的普查，進(jìn)而對(duì)超級(jí)細(xì)菌是否會(huì)波及食品安全問題進(jìn)行了一次比較科學(xué)的論證。
　　通過本論文的研究，分別構(gòu)建了針對(duì)NDM-1基因和mecA基因的經(jīng)典PCR檢測(cè)技術(shù)體系及PCR-核酸層析膠體金快速檢測(cè)方法。其中PCR-核酸層析膠體金快速檢測(cè)方法特異性和靈敏度良好、省時(shí)省力，同時(shí)還能避免凝膠電泳對(duì)操作人員帶來的健康問題。通過該方法對(duì)山東省內(nèi)禽畜肉為主的食品中是否存在“