水通道蛋白1在老化退變髓核中的表達(dá)及滲透壓、氧分壓影響其表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：水通道蛋白1(Aquaporin1,AQP-1)是一類跨膜通道蛋白家族的一員,具有特異雙向水通透性。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)水腫中,AQP-1可能參與軟骨細(xì)胞體積和水平衡的調(diào)節(jié)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)AQP-1在正常椎間盤髓核(Nucleus Pulposus,NP)表達(dá),但未見其在老化退變NP的表達(dá)及可能功能的報(bào)道。細(xì)胞外環(huán)境發(fā)生不同改變時,細(xì)胞需重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)來維持組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)。椎間盤細(xì)胞,尤其是NP細(xì)胞處于一獨(dú)特的細(xì)胞外環(huán)境中:低氧,酸性

2、和持續(xù)高應(yīng)力、高滲透壓狀態(tài)。在老化退變的椎間盤內(nèi),細(xì)胞外基質(zhì)及外環(huán)境變化,細(xì)胞必須通過不同機(jī)制,如:主動的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn),維持椎間盤的穩(wěn)態(tài)。研究表明NP細(xì)胞在不同細(xì)胞外環(huán)境改變時,其形態(tài)、功能發(fā)生顯著變化,但確切機(jī)制不明確。AQP-1可能通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)小而關(guān)鍵的分子影響細(xì)胞與外環(huán)境的交互作用。那么髓核細(xì)胞在滲透壓、氧分壓變化下發(fā)生什么樣的功能改變,AQP-1對NP細(xì)胞適應(yīng)這些變化能發(fā)揮什么樣的功能呢?
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過測定AQP-

3、1在老化退變腰椎NP中的表達(dá),初步探討其在老化退變NP的可能功能;通過觀察在不同滲透壓、氧分壓下NP細(xì)胞表達(dá)AOP-1的差異,初步探討NP細(xì)胞在滲透壓、氧分壓改變時的反應(yīng)以及AQP-1可能對NP細(xì)胞在適應(yīng)滲透壓、氧分壓變化時發(fā)揮的作用。
　　 方法：
　　 1、HE和免疫組化12只日本大白兔按年齡(0.5歲青年,1歲成年,3歲老年)分3組(n=4)。每組1只兔腰椎準(zhǔn)備HE和免疫組化染色。每組另3只兔用于免疫印跡分析。HE

4、和免疫組化染色按常規(guī)步驟進(jìn)行。所有結(jié)果在顯微鏡下觀察數(shù)碼相機(jī)取相。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)6只成年兔用于NP細(xì)胞培養(yǎng),一部分細(xì)胞種植于蓋玻片上用于HE和免疫組化染色。在不同條件下培養(yǎng)后,一部分細(xì)胞測定活性率,其余細(xì)胞置于液氮中凍存,準(zhǔn)備總RNA提取。
　　 3、細(xì)胞活性率將用于細(xì)胞活性率計(jì)數(shù)的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,稀釋。將細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)溶液混勻后,短時間內(nèi)分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞活性率。
　　 4、免疫印跡

5、分析每組3只動物腰椎NP組織快速取出后凍存。免疫印跡分析檢測在不同年齡NP組織中,AQP-1和2型膠原的表達(dá)差異。
　　 5、實(shí)時定量PCR用于檢測NP細(xì)胞關(guān)鍵蛋白和AQP-1在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、HE和免疫組化在青年和成年動物NP內(nèi),軟骨樣細(xì)胞聚集成簇,其間可見散在小的脊索細(xì)胞。老年NP內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯下降,脊索細(xì)胞消失,軟骨樣細(xì)胞肥大。軟骨樣細(xì)胞和脊索細(xì)胞均表達(dá)AQP-1陽性。體

6、外培養(yǎng)的NP細(xì)胞表現(xiàn)異型性,AQP-1和2型膠原表達(dá)陽性。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活性率在單層培養(yǎng)早期,細(xì)胞堆積成島狀,細(xì)胞多角,有大的突起,泡狀胞質(zhì)。一段時間后細(xì)胞增生為放射狀。細(xì)胞融合層疊,細(xì)胞核清晰。細(xì)胞活性率統(tǒng)計(jì)分析顯示在不同培養(yǎng)條件下,NP細(xì)胞活性無差異。
　　 3、免疫印跡2型膠原在成年和老年動物中的表達(dá)逐級顯著下降。AQP-1在成年和老年動物中均下降,以在成年動物中下降最多。
　　 4、實(shí)時定量P

7、CR在滲透壓下降時AQP-1表達(dá)明顯下調(diào),在氧分壓下降時,AQP-1表達(dá)明顯上調(diào),而在兩者均下降時,AQP-1表達(dá)呈上升趨勢。在滲透壓/氧分壓短期快速下降時,細(xì)胞功能受顯著影響,aggrecan和2型膠原表達(dá)顯著下降,滲透壓和氧分壓均下降時,兩者下降更為明顯。
　　 討論：
　　 Sowa等研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增加,兔腰椎間盤髓核發(fā)生退行性改變。Xia等研究發(fā)現(xiàn),在退變的椎間盤髓核中,2型膠原的表達(dá)隨著退變嚴(yán)重程度增加而逐漸下

8、降。這些與本實(shí)驗(yàn)在不同年齡的兔腰椎間盤中觀察到的結(jié)果相似。
　　 椎間盤老化退變降低NP細(xì)胞外滲透壓。NP細(xì)胞腫脹變形,可能通過主動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以對抗之。研究表明AQP-1被阻斷或抑制后,可以顯著增加細(xì)胞調(diào)節(jié)性體積下降,減少體積腫脹變形。在成年和老年動物髓核中,AQP-1均顯著下降。說明滲透壓下降時,NP細(xì)胞可能通過降低水的通透性,減少體積增加。在老年動物髓核中,AQP-1有所增加,說明存在其他因素影響AQP-1表達(dá),作用與滲透

9、壓相反。
　　 正常NP細(xì)胞處于低氧環(huán)境。當(dāng)椎間盤退變時,其氧分壓進(jìn)一步降低,嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。細(xì)胞可能通過獲得02改善功能。研究表明AQP-1具有O2通透性,可能輔助細(xì)胞獲得更多的O2。因此,在氧分壓降低時NP細(xì)胞可能通過增加AQP-1表達(dá)以獲得O2,減少低氧帶來的傷害。機(jī)械應(yīng)力是影響椎間盤退變的另一重要因素。隨著椎間盤老化退變的發(fā)展,應(yīng)力對細(xì)胞的傷害逐漸加重。Baetz等發(fā)現(xiàn)在AQP-1過表達(dá)情況下,細(xì)胞對抗應(yīng)力傷害的能力增

10、加。因此,在老年動物,NP細(xì)胞可能通過增加AQP-1的表達(dá),來抵抗機(jī)械應(yīng)力的傷害。
　　 Fischbarg等發(fā)現(xiàn)敲除AQP-1后,細(xì)胞表現(xiàn)顯著的調(diào)節(jié)性體積下降(僅為對照的60％)。而當(dāng)AQP-1被HgCl2或siRNA抑制后,細(xì)胞快速體積變化明顯降低。另外NP細(xì)胞可通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶來適應(yīng)滲透壓下降。該激酶可以降低AOP-1表達(dá)。因此,滲透壓降低時,NP細(xì)胞可能通過降低AQP-1表達(dá)調(diào)控水在細(xì)胞內(nèi)外分布以減少細(xì)胞體積增

11、加,進(jìn)而維持主要功能和活性。氧分壓降低時,NP細(xì)胞代謝下降。說明NP細(xì)胞需要O2參與代謝,然而其獲得O2的途徑尚不明確。研究表明AQP-1具有O2通透性,并可能輔助細(xì)胞獲得更多的02。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在氧分壓降低時,NP細(xì)胞表達(dá)AQP-1增加,說明NP細(xì)胞可能通過AQP-1獲得O2以對抗低氧分壓帶來的傷害。而當(dāng)滲透壓和氧分壓同時下降時,NPC表達(dá)AQP-1為上升趨勢,說明可能存在兩種不同的,互相矛盾的調(diào)控機(jī)制影響AQP-1的表達(dá),NP

12、細(xì)胞可能對氧分壓下降更敏感,會傾向于對自己更有利的一面調(diào)節(jié)結(jié)論AQP-1在不同年齡段兔腰椎NP組織中表達(dá)不同,反映AQP-1可能參與老化退變椎間盤NP細(xì)胞與外環(huán)境的交互作用。滲透壓和氧分壓是NP細(xì)胞外環(huán)境的重要組成因素,其改變顯著影響NP細(xì)胞功能,但未影響細(xì)胞活性。AQP-1具有水和O2通透性,能調(diào)節(jié)細(xì)胞體積和幫助細(xì)胞獲得O2。NP細(xì)胞在不同滲透壓和氧分壓下表達(dá)AQP-1不同,提示AQP-1可能參與調(diào)節(jié)NP細(xì)胞適應(yīng)滲透壓、氧分壓下降的變