磷酸酶PHLPP對TLR及RIG-I觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的選擇性調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、天然免疫應(yīng)答是由能夠識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)的受體所介導(dǎo)的，這些受體統(tǒng)稱為模式識別受體(Pattern recognitionreceptor，PRRs)。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類重要的模式識別受體，主要表達于巨噬細胞和樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)表面，特異性識別病原體中特定的分子

2、結(jié)構(gòu)，激活其下游MyD88或TRIF依賴的信號通路，激活MAPK、NFκB或者IRF3信號，最終激活天然免疫細胞產(chǎn)生炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素，構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一道屏障。TLRs在各種生物體內(nèi)高度保守，目前在小鼠中己發(fā)現(xiàn)12種TLRs。
　　 另一類受到廣泛關(guān)注的模式識別受體是維甲酸誘導(dǎo)的基因Ⅰ樣受體(retinoidacid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs)

3、，包括RIG-Ⅰ和MDA5(melanomadifferentiation-associated gene5)，它們都可以識別胞漿中的病毒RNA。常用于活化RIG-Ⅰ信號的RNA病毒有水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、仙臺病毒(Sendai virus，SeV)等。RIG-Ⅰ/MDA5識別相應(yīng)病毒RNA后，通過招募接頭分子IPS-1(Interferon-beta promoter stimu

4、lator1)等激活下游信號，引起IRF-3以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位，最終促進Ⅰ型干擾素和炎性細胞因子產(chǎn)生，激發(fā)機體抗病毒反應(yīng)。
　　 TLR及RIG-Ⅰ不僅啟動天然免疫應(yīng)答，控制炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、強度和持續(xù)時間，還可以調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的強度和類型，成為連接初始免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的橋梁。所以，TLR及RIG-Ⅰ信號過度活化或活化不足會導(dǎo)致機體免疫功能異常和疾病的發(fā)生。許多其他信號通路參與對TLR及RIG-Ⅰ信號的嚴密調(diào)控，然

5、而到目前為止，對TLR和RIG-Ⅰ信號通路調(diào)控的分子機制還沒有完全研究清楚。因此，對TLR及RIG-Ⅰ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機制的深入研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　 PHLPP(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase)是一種具有PH(pleckstrin homology)結(jié)構(gòu)域并且富含亮氨酸重復(fù)基序的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，它由N端的PH結(jié)構(gòu)域、LRR(leucine-

6、rich repeat)結(jié)構(gòu)域、PP2C(protein phosphatase2C)樣磷酸酶活性結(jié)構(gòu)域以及C端的PDZ binding結(jié)構(gòu)域組成，大鼠的同源物編碼1687個氨基酸。以前的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腦組織細胞中，PHLPP能通過其LRR區(qū)域直接與K-Ras相結(jié)合，負向調(diào)控K-Ras和MAPK信號途徑；PHLPP也能夠抑制ERK通路活化，參與大鼠腦組織長時間記憶的形成。PHLPP在多種腫瘤細胞中低表達，能夠通過PP2C樣磷酸酶活性區(qū)特

7、異性作用于Akt的473位絲氨酸，使其去磷酸化，從而抑制Akt依賴的腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。PHLPP還可以依賴其PH區(qū)域使PKC去磷酸化，從而調(diào)控細胞內(nèi)PKC的水平。這些研究提示PHLPP可通過其不同的功能域參與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。
　　 蛋白磷酸酶在免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用受到越來越多的重視。已經(jīng)報道數(shù)個磷酸酶，包括SHP-1(Src homology region2 domain-containing phosph

8、atase1)、SHP-2、SHIP-1(Src homology2 domain containing inositol-5'-phosphatase-1)和MKP-1(MAPKphosphatase-1)等，分別通過不同的機制調(diào)控TLR或RIG-Ⅰ觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答中炎性細胞因子和/或Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。那么PHLPP作為另一重要的參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的蛋白磷酸酶，是否參與天然免疫應(yīng)答中TLR及RIG-Ⅰ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控尚不清楚。

9、>　　 本實驗分三部分內(nèi)容對PHLPP是否參與天然免疫的調(diào)控以及可能的相關(guān)機制等問題進行了研究。
　　 一、PHLPP對TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的選擇性促進作用
　　 我們研究發(fā)現(xiàn)PHLPP在小鼠腦組織、脾臟及淋巴結(jié)等組織和T細胞、B細胞、NK細胞、DC、腹腔巨噬細胞以及RAW264.7細胞株等免疫細胞中廣泛表達。并且TLR配體LPS、poly(I∶C)刺激以及RIG-Ⅰ配體VSV感染可以誘導(dǎo)巨噬細

10、胞表達PHLPP蛋白增加。
　　 結(jié)果顯示PHLPP促進TLR配體誘導(dǎo)的TRIF依賴的以及RIG-Ⅰ配體誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，而對其誘導(dǎo)的炎性細胞因子產(chǎn)生以及MyD88依賴的細胞因子產(chǎn)生無明顯影響。
　　 二、PHLPP選擇性調(diào)控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機制研究
　　 為明確PHLPP各個結(jié)構(gòu)域的功能，我們根據(jù)PHLPP的分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建了不同的PHLPP缺失突變載體。瞬時轉(zhuǎn)染這些缺失突變載體后，

11、檢測對TRIF活化IFN-β報告基因的活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失LRR或者PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體不能促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性，而缺失PH或者PDZ結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體仍然能夠顯著促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性；單一表達PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體不能促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性，而表達LRR和PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體能夠顯著促進TRIF活化IFN-β報告基因的活性。同時，我們

12、發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞中瞬時轉(zhuǎn)染缺失LRR或者PP2C結(jié)構(gòu)域的PHLPP突變體不能促進poly(I：C)誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。由此認為，PHLPP正向調(diào)控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生是依賴于其LRR結(jié)構(gòu)域和磷酸酶活性結(jié)構(gòu)域PP2C。我們觀察了PHLPP對TLR及RIG-Ⅰ信號活化的MAPKs、NF-mκB的影響。
　　 結(jié)果表明巨噬細胞中PHLPP在細胞核內(nèi)通過其LRR結(jié)構(gòu)域與活化的IRF3 C端結(jié)合，通過其PP2C磷酸酶

13、活性區(qū)使IRF3 S332去磷酸化，從而抑制S332磷酸化依賴的IRF3泛素化和降解，維持IRF3蛋白的穩(wěn)定，促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　 三、PHLPP通過促進Ⅰ型干擾素產(chǎn)生而參與抵抗病毒感染的作用
　　 為探討PHLPP正向調(diào)控TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生這一功能在感染性疾病，特別是病毒感染性疾病中的作用，我們首先觀察了PHLPP對VSV復(fù)制的影響。實驗發(fā)現(xiàn)PHLPP基因敲除小鼠的腹腔巨噬細胞在VSV感染

14、后，培養(yǎng)上清中VSV病毒滴度(TCID50)顯著增加，用培養(yǎng)上清處理的HEK293細胞迅速出現(xiàn)細胞變圓等病毒感染性病變及細胞死亡；而在巨噬細胞培養(yǎng)過程中中加入重組小鼠IFN-β，可以明顯降低VSV病毒滴度，減少HEK293細胞死亡率。上述結(jié)果表明PHLPP通過促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生而抑制了VSV的復(fù)制。
　　 進一步我們?nèi)⌒∈篌w內(nèi)感染VSV24-48小時之后的臟器檢測病毒感染情況，發(fā)現(xiàn)PHLPP基因敲除小鼠的肝臟和脾臟組織中VSV

15、的復(fù)制和病毒滴度(TCID50)較對照小鼠顯著增加，表明PHLPP在體內(nèi)參與了抵抗VSV感染的效應(yīng)。
　　 本部分研究表明PHLPP通過促進體內(nèi)TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抑制VSV的復(fù)制，提高小鼠對VSV體內(nèi)感染的抵抗能力，提示其在抵御病毒感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。
　　 綜合以上三部分研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)磷酸酶PHLPP參與了巨噬細胞中TLR及RIG-Ⅰ觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的正向調(diào)控；證明了PHLPP