豬維甲酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)的克隆及其在誘導(dǎo)-型干擾素中的作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、機體的天然免疫系統(tǒng)在抵抗病毒感染方面發(fā)揮著重要作用。病毒感染宿主細胞后,宿主細胞可以通過模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)偵測病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs)的存在,從而激活宿主的天然免疫反應(yīng),誘導(dǎo)干擾素(IFN)、促炎癥細胞因子等一系列抗病毒因子的產(chǎn)生。Toll樣受體(Toll-likereceptor,TLR)家族

2、是一類重要的PRR,在RNA病毒的識別過程中發(fā)揮重要作用,如TLR3識別dsRNA:TLR7和TLR8識別ssRNA等。但由于TLR家族成員均為跨膜蛋白,只能識別細胞外或內(nèi)體中的RNA病毒,對于細胞質(zhì)中的RNA病毒,TLR則無法做出反應(yīng)。RIG-Ⅰ樣受體(RIG-I-like receptor,RLR)是一類新發(fā)現(xiàn)的PRR,能夠識別細胞質(zhì)中的病毒RNA,誘導(dǎo)干擾素和促炎癥細胞因子的產(chǎn)生,對抗病毒天然免疫的建立起著至關(guān)重要的作用。

3、   對人RIG-Ⅰ基因的結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的機制等已研究較為清楚,但有關(guān)豬RIG-Ⅰ的研究尚無報道,鑒于此,本研究對豬RIG-Ⅰ進行了克隆,并對其在誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素中的作用做了初步研究。
   主要研究內(nèi)容如下:
   1.豬RIG-Ⅰ基因克隆與序列分析。
   取豬的外周血單核細胞總RNA作模板RT-PCR(一步法)擴增豬RIG-Ⅰ基因,插入pMD18-T載體中構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-RIG-Ⅰ,序列分析

4、發(fā)現(xiàn)豬RIG-Ⅰ開放讀碼框全長為2832 bps,編碼943個氨基酸殘基。與牛、馬、人、黑猩猩、猴的氨基酸同源性分別為82.3%、80.2%、80.2%、79.7%、和78.8%,與小鼠、大鼠和鴨嘴獸的同源性較低,進化系統(tǒng)樹分析也表明豬RIG-Ⅰ氨基酸序列與牛的親緣關(guān)系最近。
   2.豬RIG-Ⅰ基因全長及突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
   以pMD18-RIG-Ⅰ為模板,PCR分別擴增RIG-Ⅰ全長編碼區(qū)、RIG-ⅠN端以

5、及RIG-ⅠC端編碼區(qū)片段,將純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后分別與經(jīng)同樣酶切的真核表達載體pCMV-Tag-2B連接,獲得的重組質(zhì)粒分別命名為Tag-RIG-Ⅰ,Tag-RIG-Ⅰ-N和Tag-RIG-Ⅰ-C。
   3.豬RIG-Ⅰ在誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生中的作用。
   將真核表達質(zhì)粒Tag-RIG-Ⅰ、Tag-RIG-Ⅰ-N、Tag-RIG-Ⅰ-C分別轉(zhuǎn)染PK-15細胞,通過熒光素酶報道系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)

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