RIG-I抑制胰島β細(xì)胞增殖機(jī)制研究.pdf

1、目的:RIG-Ⅰ(retinoic acid inducible gene-Ⅰ)是一個(gè)典型的胞內(nèi)模式識(shí)別受體，能識(shí)別胞內(nèi)病毒雙鏈RNA，激活并參與多種炎癥因子表達(dá)的調(diào)節(jié)。最近有研究表明:1型糖尿病中，RIG-Ⅰ能激活，且參與胰島β細(xì)胞功能下調(diào)及糖尿病的發(fā)生。而RIG-Ⅰ是否參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展并不清楚。本研究旨在探討RIG-Ⅰ對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制極其對(duì)β細(xì)胞功能失代償?shù)挠绊憽?br>　　方法:采用糖脂毒性（0.4 mM棕櫚酸+

2、16.7 mM葡萄糖）、炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)刺激胰島Min6細(xì)胞，并提取糖尿病db/db小鼠的胰島，建立胰島β細(xì)胞體外和體內(nèi)2型糖尿病模型。免疫印跡(Westernblot)技術(shù)分別檢測(cè)激活的原癌基因Src(sarcoma gene)及RIG-Ⅰ的蛋白水平變化;免疫熒光觀察磷酸化Src(Y416)及RIG-Ⅰ的含量變化;EdU熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)分別評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程的變化。給予RIG-Ⅰ特異性激

3、活劑維甲酸(retinoic acid，RA)激活RIG-Ⅰ，Real-time RT-PCR和Western blot測(cè)定RIG-Ⅰ的mRNA水平及蛋白水平;噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)胰島β細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，EdU熒光標(biāo)記分析胰島β細(xì)胞增殖情況，并用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞的周期進(jìn)程變化。采用胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(Insulin like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)和維甲酸聯(lián)合處理Min6細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量RT-PCR和免疫印

4、跡分別檢測(cè)Src基因下游信號(hào)分子Skp2、STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3)及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、E、CDK2、P27和p21的mRNA和蛋白水平;免疫熒光觀察磷酸化STAT3亞細(xì)胞定位;熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferase Assay)分析STAT3的轉(zhuǎn)錄活性;免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)檢測(cè)p-S

5、rc分別與RIG-Ⅰ、STAT3的蛋白結(jié)合變化。
　　結(jié)果:糖脂毒性(glucolipotoxicity)、炎癥因子（TNF-α）及脂多糖(LPS)能顯著上調(diào)胰島β細(xì)胞磷酸化Src及RIG-Ⅰ的蛋白水平;上調(diào)的RIG-Ⅰ導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的增殖能力和生長(zhǎng)活力都明顯下降，細(xì)胞凋亡增加，且細(xì)胞周期阻滯于G1期;胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ處理Min6細(xì)胞后，RIG-Ⅰ的激活對(duì)cyclin D1、E、CDK2、P27和p21的mRNA水平均無(wú)顯著影

6、響，但誘導(dǎo)P27蛋白含量顯著上調(diào);RIG-Ⅰ激活也抑制了Src基因下游信號(hào)分子Skp2的表達(dá)、減弱了磷酸化STAT3的轉(zhuǎn)錄活性且阻礙了Src與STAT3的蛋白相互結(jié)合。
　　結(jié)論:糖脂毒性、炎癥因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)能顯著激活胰島β細(xì)胞的Src活性。RIG-Ⅰ的上調(diào)能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合激活Src，從而阻礙p-Src與STAT3的蛋白結(jié)合，下調(diào)Skp2的蛋白水平和上調(diào)周期蛋白P27的表達(dá)，最終誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞G1期阻滯，抑制其增