轉(zhuǎn)錄因子SP1蛋白在心臟缺氧預(yù)適應(yīng)及藥物預(yù)適應(yīng)中對SERCA2a啟動子活性的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：缺氧預(yù)適應(yīng)具有強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)作用,維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)可能是重要機(jī)制之一。肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均會影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,SP1蛋白為與GC核相連的轉(zhuǎn)錄因子,其位于細(xì)胞核內(nèi),通過信號通路介導(dǎo)SERCA2a啟動子轉(zhuǎn)錄活性。對SERCA2a在缺氧預(yù)適應(yīng)過程中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究有可能從基因表達(dá)調(diào)控層面揭示SERCA2a在缺氧預(yù)適應(yīng)中的作用和機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)旨在探討大鼠心肌轉(zhuǎn)錄因子SP1蛋白在心臟缺氧預(yù)適應(yīng)及藥物預(yù)適

2、應(yīng)中對SERCA2a啟動子活性的調(diào)節(jié)。 方法： 1.用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法體外培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞； 2.用化學(xué)耗氧法模擬體內(nèi)心肌缺血建立缺氧預(yù)適應(yīng)和缺氧-復(fù)氧損傷模型,建立藥物預(yù)處理模型,并隨機(jī)分成5個處理組：正常培養(yǎng)組(Control)、腺苷預(yù)處理組(AP)、缺氧預(yù)適應(yīng)組(HP)和藥物預(yù)處理組(前胡丙素)、缺氧-復(fù)氧損傷組(HR); 3.用乳酸→丙酮酸法檢測細(xì)胞上清LDH值； 4.分別予

3、Fluo-3/AM和Annexin-v熒光染色劑負(fù)載細(xì)胞后,利用共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度； 5.用免疫印跡法檢測SERCA2a的蛋白表達(dá)水平； 6.用熒光素酶報道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,加入熒光素酶底物,用液閃儀測量不同組啟動子活性； 7.對啟動子質(zhì)?；騽h除,檢測新建質(zhì)粒在不同組的活性； 8.用半定量RT-PCR法檢測SPl的基因轉(zhuǎn)錄水平； 9.用免疫印跡法檢測SP1的蛋白表達(dá)水平。

4、結(jié)果： 1.同缺氧-復(fù)氧損傷組(HR組)比較,缺氧預(yù)適應(yīng)組(HP組)、前胡丙素預(yù)處理組(PP組)的LDH值和單細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度值明顯降低(P＜0.05),而且PP組與其它干預(yù)組之間無顯著差異性(P＞0.05); 2.同缺氧-復(fù)氧損傷組(HR組)比較,AP組及HP組和PP組的SERCA2a蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05),而且AP組及HP組和PP組之間無顯著性差別(P＞0.05); 3.同缺氧-復(fù)氧損傷組(HR組)

5、比較,AP組及HP組和PP組的啟動子活性明顯增加(P＜0.05),而且AP組及HP組和PP組之間無顯著性差別(P＞0.05); 4.同缺氧-復(fù)氧損傷組(HR組)比較,AP組及HP組和PP組的新建啟動子活性明顯增加(P＜0.05),而且AP組及HP組和PP組之間無顯著性差別(P＞0.05); 5.同缺氧-復(fù)氧損傷組(HR組)比較,HP組和PP組的SP1基因轉(zhuǎn)錄明顯降低(P＜0.05),而且AP組及HP組和PP組之間無顯著性

6、差別(P＞0.05); 6.同缺氧-復(fù)氧損傷組(HR組)比較,AP組及HP組和PP組的SP1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05),而且AP組及HP組和PP組之間無顯著性差別(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.在缺氧-復(fù)氧損傷中SERCA2a蛋白表達(dá)水平及其啟動子活性明顯下調(diào),缺氧預(yù)適應(yīng)可能抑制SERCA2a蛋白表達(dá)水平及其啟動子活性的下降,延緩細(xì)胞內(nèi)鈣超載,減輕心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷,最終實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)性作用；