沉默SP1表達對胃癌細胞PIWIL1表達及其啟動子活性的影響.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)干擾胃癌細胞（BGC-823）sp1基因的表達，探索其對PIWIL1在mRNA及蛋白水平表達及其啟動子活性的影響，為進一步探索PIWIL1在胃癌細胞中的作用機制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.將不同劑量的SP1-siRNA通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至胃癌細胞BGC-823，通過Western印跡檢驗SP1-siRNA的干擾效率，篩選出SP1 si RNA的發(fā)揮最佳干擾效率時si RN

2、A的濃度。
　　2.將不同劑量的SP1-siRNA(0，40nM)通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至胃癌細胞BGC-823，通過WB技術(shù)研究PIWIL1蛋白的表達變化。
　　3.將不同劑量的SP1-siRNA(0，40nM)通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至胃癌細胞BGC-823，通過RT-PCR技術(shù)研究PIWIL1 mRNA的表達變化。
　　4.將不同劑量SP1-siRNA(0，40nM)與PIWIL1啟動子的報告基因載體共轉(zhuǎn)BGC-823

3、細胞，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測SP1對PIWIL1轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　5.統(tǒng)計學分析:實驗組和對照組以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。分析方法采用LSD-t檢驗進行實驗組和對照組的兩兩比較，并以雙側(cè)P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù)Western印跡結(jié)果，通過Quantity one軟件進行分析，同時考慮到節(jié)約實驗耗材，選擇SP1-siRNA終濃度為40 nM時可達到最佳干擾效果。
　　

4、2.根據(jù)Western印跡結(jié)果，通過Quantity one軟件進行分析，干擾胃癌細胞BGC-823 SP1表達后，PIWIL1蛋白的表達也隨之下降，從而說明，在蛋白水平上PIWIL1的表達與SP1的表達有相關(guān)性，且有可能是正相關(guān)的關(guān)系。
　　3.根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果，干擾胃癌細胞BGC-823 SP1表達后，PIWlL1 mRNA表達也隨之下降，從而說明，在基因水平上PIWlL1的表達與SP1的表達有相關(guān)性，且有可能是正相關(guān)

5、的關(guān)系。
　　4.不同劑量的SP1-siRNA、 PIWlL1啟動子的報告基因載體PGL3-Basic-PIWIL1(-266/-23)、PGL3Basic-PlWIL1(-1304/-23)及內(nèi)參照質(zhì)粒PRL-TK成功共轉(zhuǎn)染至BGC-823細胞，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各組PIWIL1活性變化，經(jīng)LSD-t法檢驗，實驗組與對照組間有統(tǒng)計學差異（P=0.000，P=0.000），顯示了SP1沉默后可明顯下調(diào)PIWIL1的核心啟動子的