Aβ調控自噬能量的效果及其分子機制研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種老年人中常見的以認知障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經系統(tǒng)退行性疾病。AD隱匿起病，發(fā)病機制至今仍未闡明。近年來，由于自噬障礙導致的AD中蛋白質修飾和降解異常成為新的研究熱點。在AD典型病理特征出現(xiàn)之前，患者腦內已經有大量的自噬體存在，提示自噬可能是AD患者腦內的早期病理反應。本研究旨在篩選和建立穩(wěn)定表達自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associat

2、ed protein1 light chain3，LC3)的細胞系，并用于研究Aβ調控細胞自噬通量(autophagy flux)的效果，及其對細胞生長的作用和可能的機制。
　　方法:(1)構建穩(wěn)定表達EGFP-LC3的HEK293細胞系。本文通過比較細胞轉染效率和LC3蛋白表達水平，從6種細胞中篩選用于建系的細胞種類。摸索并確定遺傳霉素(geneticin，G418)的濃度，轉染EGFP-LC3表達質粒，對細胞進行壓力選擇性篩選

3、。(2)建立Aβ誘導自噬的細胞模型。通過熒光顯微鏡觀察，明確細胞內Aβ過量表達以及細胞外Aβ多肽處理這兩種途徑誘導EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細胞自噬的效果，并進一步探討劑量、時間以及Aβ聚集狀態(tài)與自噬的關系。用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）確認自噬體的細胞超微結構特征。(3)Aβ誘導細胞自噬的初步機制。以10μmol/L的Aβ40、Aβ42全長肽以及疏水性氨基酸含量不同

4、的4種Aβ截短形式(Aβ1-11、Aβ12-24、Aβ25-35和Aβ35-42)分別處理EGFP-LC3穩(wěn)定細胞24 h，用熒光顯微鏡觀察并計數LC3的熒光斑點數;用Western blot檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ、p62、HSP70及HSP90表達量的變化;用MTT檢測特定Aβ誘導細胞自噬過程中伴隨的細胞活力的改變情況。
　　結果:(1)成功構建了穩(wěn)定表達EGFP-LC3的細胞系。用700μg/mL的G418加壓篩選6周，獲

5、得EGFP-LC3陽性率為100％的穩(wěn)定細胞系EGFP-LC3-HEK293。(2)成功建立Aβ誘導自噬的細胞模型。細胞內Aβ過量表達以及細胞外Aβ多肽處理這兩種途徑均可以誘導細胞內出現(xiàn)明顯的LC3熒光斑點，并且具有劑量依賴性、時間依賴性以及二級結構依賴性。確定后續(xù)實驗選用的條件為:聚合24 h的Aβ寡聚體以10μmol/L的濃度處理細胞24 h。在細胞超微結構水平，TEM證實了Aβ可以誘導自噬體的出現(xiàn)。(3) Aβ誘導自噬的機制研究。

6、首先，熒光顯微鏡結果顯示，不同形式Aβ肽均可以誘導細胞自噬激活，并且Aβ25-35、Aβ40和Aβ42誘導細胞內LC3熒光斑點的效果更明顯。誘導自噬的效果與疏水性氨基酸含量無關。其次，Western blot結果顯示，與對照組相比，Aβ42組及陽性對照組中LC3BⅡ均有所增加，LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值伴隨細胞自噬增強而增加，提示LC3酯化程度的加強。同時，伴隨自噬的激活，p62蛋白的表達量相應減少，提示自噬促進其降解。經巴弗洛霉素A

7、1(bafilomycin A1，BafA1)阻斷自噬-溶酶體形成的環(huán)節(jié)后，與空白對照組相比，LC3BⅡ表達水平以及LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值(p＜0.01)增加更明顯，同時p62的表達水平未見降低。與Aβ42處理組相比，Aβ42+BafA1組中LC3BⅡ表達水平、LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值(p＜0.01)以及p62表達水平(p＜0.05)明顯增加。同樣，與血清去除組相比，血清去除+Baf A1組中LC3BⅡ表達水平、LC3BⅡ/L

8、C3BⅠ的比值(p＜0.05)以及p62表達水平(p＜0.01)也明顯增加。在熱休克蛋白應激方面，與空白組相比，Aβ42組及血清去除組中HSP90表達量增加，而HSP70表達量減弱。最后，MTT結果顯示，與Aβ40相比，Aβ42處理后伴隨自噬表現(xiàn)出的細胞毒性更強(p＜0.05)。
　　結論:本研究成功構建了EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細胞系，在細胞水平證實了Aβ誘導自噬的效應和機制，并證明Aβ誘導自噬與其細胞毒性相關。為進一