Aβ調(diào)控自噬能量的效果及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種老年人中常見的以認(rèn)知障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD隱匿起病，發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明。近年來，由于自噬障礙導(dǎo)致的AD中蛋白質(zhì)修飾和降解異常成為新的研究熱點(diǎn)。在AD典型病理特征出現(xiàn)之前，患者腦內(nèi)已經(jīng)有大量的自噬體存在，提示自噬可能是AD患者腦內(nèi)的早期病理反應(yīng)。本研究旨在篩選和建立穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associat

2、ed protein1 light chain3，LC3)的細(xì)胞系，并用于研究Aβ調(diào)控細(xì)胞自噬通量(autophagy flux)的效果，及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用和可能的機(jī)制。
　　方法:(1)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的HEK293細(xì)胞系。本文通過比較細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和LC3蛋白表達(dá)水平，從6種細(xì)胞中篩選用于建系的細(xì)胞種類。摸索并確定遺傳霉素(geneticin，G418)的濃度，轉(zhuǎn)染EGFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行壓力選擇性篩選

3、。(2)建立Aβ誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞模型。通過熒光顯微鏡觀察，明確細(xì)胞內(nèi)Aβ過量表達(dá)以及細(xì)胞外Aβ多肽處理這兩種途徑誘導(dǎo)EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細(xì)胞自噬的效果，并進(jìn)一步探討劑量、時(shí)間以及Aβ聚集狀態(tài)與自噬的關(guān)系。用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）確認(rèn)自噬體的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征。(3)Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的初步機(jī)制。以10μmol/L的Aβ40、Aβ42全長(zhǎng)肽以及疏水性氨基酸含量不同

4、的4種Aβ截短形式(Aβ1-11、Aβ12-24、Aβ25-35和Aβ35-42)分別處理EGFP-LC3穩(wěn)定細(xì)胞24 h，用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)LC3的熒光斑點(diǎn)數(shù);用Western blot檢測(cè)LC3BⅡ/LC3BⅠ、p62、HSP70及HSP90表達(dá)量的變化;用MTT檢測(cè)特定Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過程中伴隨的細(xì)胞活力的改變情況。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的細(xì)胞系。用700μg/mL的G418加壓篩選6周，獲

5、得EGFP-LC3陽性率為100％的穩(wěn)定細(xì)胞系EGFP-LC3-HEK293。(2)成功建立Aβ誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞模型。細(xì)胞內(nèi)Aβ過量表達(dá)以及細(xì)胞外Aβ多肽處理這兩種途徑均可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的LC3熒光斑點(diǎn)，并且具有劑量依賴性、時(shí)間依賴性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴性。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用的條件為:聚合24 h的Aβ寡聚體以10μmol/L的濃度處理細(xì)胞24 h。在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平，TEM證實(shí)了Aβ可以誘導(dǎo)自噬體的出現(xiàn)。(3) Aβ誘導(dǎo)自噬的機(jī)制研究。

6、首先，熒光顯微鏡結(jié)果顯示，不同形式Aβ肽均可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬激活，并且Aβ25-35、Aβ40和Aβ42誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)的效果更明顯。誘導(dǎo)自噬的效果與疏水性氨基酸含量無關(guān)。其次，Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ42組及陽性對(duì)照組中LC3BⅡ均有所增加，LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值伴隨細(xì)胞自噬增強(qiáng)而增加，提示LC3酯化程度的加強(qiáng)。同時(shí)，伴隨自噬的激活，p62蛋白的表達(dá)量相應(yīng)減少，提示自噬促進(jìn)其降解。經(jīng)巴弗洛霉素A

7、1(bafilomycin A1，BafA1)阻斷自噬-溶酶體形成的環(huán)節(jié)后，與空白對(duì)照組相比，LC3BⅡ表達(dá)水平以及LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值(p＜0.01)增加更明顯，同時(shí)p62的表達(dá)水平未見降低。與Aβ42處理組相比，Aβ42+BafA1組中LC3BⅡ表達(dá)水平、LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值(p＜0.01)以及p62表達(dá)水平(p＜0.05)明顯增加。同樣，與血清去除組相比，血清去除+Baf A1組中LC3BⅡ表達(dá)水平、LC3BⅡ/L

8、C3BⅠ的比值(p＜0.05)以及p62表達(dá)水平(p＜0.01)也明顯增加。在熱休克蛋白應(yīng)激方面，與空白組相比，Aβ42組及血清去除組中HSP90表達(dá)量增加，而HSP70表達(dá)量減弱。最后，MTT結(jié)果顯示，與Aβ40相比，Aβ42處理后伴隨自噬表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性更強(qiáng)(p＜0.05)。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系，在細(xì)胞水平證實(shí)了Aβ誘導(dǎo)自噬的效應(yīng)和機(jī)制，并證明Aβ誘導(dǎo)自噬與其細(xì)胞毒性相關(guān)。為進(jìn)一