組織工程尿道的初步研究.pdf

1、尿道組織工程的初步研究組織工程是一門新興學(xué)科，它是利用生物學(xué)和工程學(xué)原理研究、開發(fā)用于修復(fù)、維持和改善損傷組織功能的組織替代物的一門學(xué)科。自從80年代正式確立以來，已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，目前處于研發(fā)階段的組織工程產(chǎn)品很多。組織工程產(chǎn)品不但解決了供者器官來源不足的問題，而且大幅減輕了發(fā)生異體移植物排斥反應(yīng)的危險。 本試驗研究目的是研究尿道上皮與平滑肌及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，探討以膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(bladderacell

2、ularmatrixgraft，BAMG)為支架進(jìn)行以上細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法和可行性，為利用組織工程技術(shù)進(jìn)行尿道重建提供實驗基礎(chǔ)。 實驗主要包括以下五個部分：第一部分探討了兔尿路移行上皮(UEC)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，手術(shù)獲取兔尿道粘膜標(biāo)本，以組織塊法，添加有50μg/ml牛垂體提取物，5ng/ml表皮生長因子DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果添加BPE與rEGF較DMEM/F12體系適合UEC生長，組織塊接種后5～7天可見上皮細(xì)

3、胞生長，至12～14天可傳代。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)與透射電鏡檢查證實為兔UEC細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線與細(xì)胞貼壁率曲線均顯示細(xì)胞的良好生長活性。細(xì)胞凍存三個月后復(fù)蘇細(xì)胞形態(tài)與生命力維持正常。本部分實驗推知DMEM/F12能促進(jìn)UEC體外增殖，可獲得大量UEC種子細(xì)胞。 第二部分討論了兔尿路平滑肌細(xì)胞(USMC)的體外原代培養(yǎng)。在無菌條件下獲取兔尿道平滑肌標(biāo)本。用復(fù)合酶消化法，消化液含有0.2％Ⅰ型膠原酶、2.5mg/mlDispase、3％

4、胎牛血清(FBS)；在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化。結(jié)果復(fù)合酶消化5～7h后可收集一定細(xì)胞并接種培養(yǎng)。大約7天可傳代。細(xì)胞經(jīng)凍存與復(fù)蘇后生長活力無顯著差異。經(jīng)α-actin免疫組織化學(xué)鑒定所得細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞(SMC)。本實驗培養(yǎng)的兔USMC生長力旺盛，可傳代6～7次，所得細(xì)胞經(jīng)鑒定為SMC，可為尿路組織工程與其他細(xì)胞生物學(xué)實驗提供豐富的細(xì)胞來源。 第三部分嘗試構(gòu)建尿道細(xì)胞—脫細(xì)胞基質(zhì)支架支架復(fù)合體。我們以從從兔膀胱中提取制成脫細(xì)胞基質(zhì)作

5、為細(xì)胞支架，將實驗獲得的細(xì)胞單獨接種于BAMG的一側(cè)、兩種細(xì)胞分別接種于同一支架的兩側(cè)，每7天取出標(biāo)本進(jìn)行HE染色，觀察細(xì)胞在基質(zhì)上的生長情況。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)此種方法可制備出細(xì)胞—支架復(fù)合體。本研究一方面證實了我們培養(yǎng)出的尿路細(xì)胞進(jìn)行組織工程后續(xù)實驗的能力，另一方面也證實該BAMG可作為細(xì)胞生長的底物，能促進(jìn)細(xì)胞黏附與生長。 第四部分獲取幼兔骨髓組織，采用梯度離心法在體外用αDMEM培養(yǎng)液進(jìn)行MSCs分離培養(yǎng)。結(jié)果原代骨髓間充質(zhì)干

6、細(xì)胞在經(jīng)過傳代換液后，基本得到純化，約10～12天時間擴(kuò)增形成單層。可傳代培養(yǎng)8代。細(xì)胞凍存后復(fù)蘇細(xì)胞形態(tài)與生命力維持正常。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明細(xì)胞表面抗原CD44+，CD45-，與國際相關(guān)報道一致。本試驗證實了兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞生長力旺盛，可傳代多次，可用作尿道組織工程的種子細(xì)胞。 第五部分嘗試構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞—脫細(xì)胞基質(zhì)支架支架復(fù)合體。將培養(yǎng)出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，接種于脫細(xì)胞基質(zhì)一側(cè)。于3-6天取出后以掃描電