組織工程肺血管化的初步研究.pdf

1、目的:慢性阻塞性肺疾病、肺間質(zhì)纖維化等慢性肺部疾病嚴重影響人類健康，而發(fā)展至終末期則治療方法非常有限。肺移植術受供體來源及需要術后免疫抑制的限制很難得到廣泛開展。應用組織工程技術構建組織工程肺替代移植肺組織成為治療的新選擇及研究方向。血液供應、循環(huán)再建是組織工程肺能否在受體內(nèi)長期存活的關鍵。本研究應用大鼠肺來源間充質(zhì)干細胞(Lr-MSCs)、骨髓內(nèi)皮祖細胞(EPCs)以及肺泡Ⅱ型上皮細胞(AT-Ⅱ)作為種子細胞，以Matrigel作為生

2、物支架，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染Lr-MSCs過表達堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，在大鼠體內(nèi)構建組織工程肺，觀察新生血管的形成情況及其對組織工程肺體內(nèi)存活情況的影響。
　　方法:1.采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)Lr-MSCs、密度梯度離心法分離培養(yǎng)EPCs、差速貼壁及免疫吸附法分離AT-Ⅱ，以三種細胞為種子細胞，以Matrigel為生物支架，于體外構建組織工程肺泡樣結構，通過HE染色、SP-A免疫組化以及透射電鏡對組織工程肺泡樣結構進

3、行分析評價;2.以慢病毒為載體，將bFGF基因轉(zhuǎn)染至Lr-MSCs，ELISA法測定其過表達bFGF的情況，評價轉(zhuǎn)染bFGF基因的Lr-MSCs細胞上清液對EPCs遷移及成管能力的影響;3.將種子細胞分為三種組合:Lr-MSCs/EPCs/AT-Ⅱ（對照組，C組）、vector-Lr-MSCs/EPCs/AT-Ⅱ（病毒載體組，V組）、bFGF-Lr-MSCs/EPCs/AT-Ⅱ(bFGF轉(zhuǎn)染組，F(xiàn)組)，通過皮下注射的方式在大鼠體內(nèi)進行組

4、織工程肺的構建，應用免疫組織化學的方法檢測新生組織內(nèi)SP-A、CD31以及α-SMA的表達，并進行定量分析，比較各組在2、3、4周時新生血管的形成及AT-Ⅱ細胞的存活情況。
　　結果:1.三種種子細胞與Matrigel進行體外3D培養(yǎng)過程中可見圓形島狀生長的AT-Ⅱ逐漸聚集呈細胞團，細胞團逐漸增大，約2周左右細胞團中央細胞逐漸消散，形成“花環(huán)樣”結構;HE染色結果提示“花環(huán)樣”結構與正常大鼠肺臟組織近似;免疫組織化學檢測，組成“花

5、環(huán)樣”結構的細胞及細胞外均可見SP-A表達;透射電鏡檢查可見組成“花環(huán)樣”結構的細胞游離緣有微絨毛，胞核周圍有同心圓形的板層小體分布，證實AT-Ⅱ細胞存在，并保持外分化狀態(tài)。2.與Lr-MSCs及僅轉(zhuǎn)染病毒載體的Lr-MSCs比較，轉(zhuǎn)染bFGF基因的Lr-MSCs的細胞上清液中bFGF濃度明顯增高(p＜0.05);轉(zhuǎn)染bFGF基因的Lr-MSCs細胞上清液可明顯增加EPCs的遷移能力(p＜0.05)，縮短EPCs的成管時間(p＜0.05

6、)。3.與對照組、病毒載體組比較，bFGF轉(zhuǎn)染組構建的組織工程肺在3周及4周時CD31及α-SMA表達量明顯增多(p＜0.05)，而2周時三組CD31及α-SMA表達量無明顯差別(p＞0.05);三組組織內(nèi)SP-A表達量隨時間逐漸減少，但三組之間各時間點SP-A的表達量無明顯差異(p＞0.05)。
　　結論:1.應用Lr-MSCs、EPCs及AT-Ⅱ三種細胞作為種子細胞，Matrigel為生物支架，在體外及體內(nèi)均可成功構建組織工程