組織工程化尿道海綿體構(gòu)建的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題應(yīng)用組織工程技術(shù)，構(gòu)建組織工程化尿道海綿體，移植修復(fù)兔海綿體尿道(尿道海綿體和尿道的簡(jiǎn)稱(chēng))缺損，探索構(gòu)建組織工程化尿道海綿體的方法和技術(shù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為以下三個(gè)部分： 1.兔脫細(xì)胞尿道海綿體-尿道基質(zhì)(CS-UECM)的制備。 2.種子細(xì)胞的獲取、擴(kuò)增及標(biāo)記。包括三種種子細(xì)胞。 1)尿道海綿體平滑肌細(xì)胞(CSMC)的原代培養(yǎng)和擴(kuò)增。 2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的原代培養(yǎng)擴(kuò)增及標(biāo)記。 3)

2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞。 3.組織工程化尿道海綿體的構(gòu)建及修復(fù)兔海綿體尿道缺損。 第一章兔脫細(xì)胞尿道海綿體-尿道基質(zhì)的制備。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：3月齡雄性新西蘭兔，體重2.5～3Kg。Triton-X100、NH3·H2O、恒溫?fù)u床等。 研究方法：取健康成年雄性新西蘭兔完整尿道及海綿體組織，以Triton-X100與NH3·H2O混合液進(jìn)行萃取脫細(xì)胞處理。標(biāo)本作病理組織HE染色，觀察分析脫

3、細(xì)胞效果。 研究結(jié)果：制備的CS-UECM質(zhì)地柔軟，鏡下可見(jiàn)主要成份是膠原及彈性纖維，且排列規(guī)則，未見(jiàn)細(xì)胞成份。 研究結(jié)論：用Triton-X100+NH3·H2O聯(lián)合萃取脫細(xì)胞可制備兔CS-UECM。 第二章種子細(xì)胞的獲取、擴(kuò)增及標(biāo)記。 1.尿道海綿體平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和擴(kuò)增。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：2月齡雄性新西蘭兔，體重1.5～2Kg。DMEM-HG、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、胎牛血清

4、(FBS)、平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(SMα-actin)、SABC試劑盒及DAB染色試劑盒。 研究方法：切取新西蘭兔陰莖頭約1/2，采用組織塊法用含10％胎牛血清的高糖DMEM作體外原代培養(yǎng)，并行免疫組化法鑒定。 研究結(jié)果：經(jīng)10～14d培養(yǎng)后，培養(yǎng)瓶底鋪滿梭狀細(xì)胞，免疫組化法鑒定確認(rèn)為兔尿道海綿體平滑肌細(xì)胞。 研究結(jié)論：采用組織塊法能成功培養(yǎng)兔尿道海綿體平滑肌細(xì)胞。 2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)擴(kuò)增及標(biāo)記

5、。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：2月齡雄性新西蘭兔，體重1.5～2Kg。DMEM-LG、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)、重組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因腺相關(guān)病毒載體(AAV-EGFP)。 研究方法：采用全骨髓法分離培養(yǎng)BMSC，在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染AAV-EGFP，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及熒光表達(dá)的時(shí)間及強(qiáng)度，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，確定最佳轉(zhuǎn)染MOI值，MTT法描記細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察腺相關(guān)病毒載體(AAV)對(duì)細(xì)胞活性的影響。

6、 研究結(jié)果：細(xì)胞擴(kuò)增迅速、形態(tài)良好、純度較高。實(shí)驗(yàn)確定AAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最佳MOI值為1×105，以此值轉(zhuǎn)染AAV-EGFP后細(xì)胞熒光持續(xù)高效穩(wěn)定表達(dá)，可滿足示蹤標(biāo)記的需要。AAV轉(zhuǎn)染效率高(＞90％)，對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著影響。 研究結(jié)論：采用直接貼壁法培養(yǎng)，可以獲得純度較高的BMSC。轉(zhuǎn)染后BMSC熒光穩(wěn)定表達(dá)，可作為種子細(xì)胞良好的示蹤標(biāo)記方法。 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：

7、2月齡雄性新西蘭兔，體重1.5～2Kg。小鼠抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(SMα-actin)、Cy3-羊抗小鼠IgG、DMEM-LG、Trypsin、胎牛血清。流式細(xì)胞儀、超凈臺(tái)等。 研究方法：誘導(dǎo)分化采用共培養(yǎng)誘導(dǎo)和直接誘導(dǎo)兩種方法 1).共培養(yǎng)誘導(dǎo)：BMSC用Hoechst33342進(jìn)行細(xì)胞核的標(biāo)記，接種至六孔板，每孔內(nèi)加入不同比例(4∶2∶1、1∶1)的兔尿道海綿體平滑肌細(xì)胞(CSMC)進(jìn)行共培養(yǎng)，2天后進(jìn)行熒光免疫細(xì)

8、胞化學(xué)測(cè)定SMα-actin表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照組。 2).直接誘導(dǎo)：分兩組，細(xì)胞接種到六孔板后添加含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和VEGF加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2天后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組以及陽(yáng)性對(duì)照組。 研究結(jié)果：對(duì)不同組別誘導(dǎo)率方差分析得各組總體均數(shù)差異性檢驗(yàn)，P＜0.05，表明統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異。 研究結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)添加生長(zhǎng)因子(VEGF

9、及b-FGF)和共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞，其中以共培養(yǎng)方法效率較高。 第三章組織工程化尿道海綿體的構(gòu)建及修復(fù)兔海綿體尿道缺損。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：3月齡雄性新西蘭兔，體重2.5～3Kg。DMEM-LG、Trypsin、胎牛血清。超凈臺(tái)、顯微外科器械等。 研究方法：CS-UECM在含0.1％纖粘連蛋白培養(yǎng)基中培育24h，用酶消化法收集培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSC，并將其濃縮為1×106/cm2的密度，之后在超凈臺(tái)內(nèi)將細(xì)

10、胞懸液接種到CS-UECM的內(nèi)外表面。將細(xì)胞材料復(fù)合體置于六孔板內(nèi)，在37℃的孵箱內(nèi)進(jìn)行培育24h，補(bǔ)加培養(yǎng)基。 48只家兔隨機(jī)分2組：種植BMSC的CS-UECM移植組(A組)，未種植BMSC組的CS-UECM移植組(B組)。A、B組均切除尿道1.5cm后用長(zhǎng)1.5cm的CS-UECM修復(fù)，術(shù)后1，2，4，8，12，24周切取標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)檢查。 研究結(jié)果：A組自術(shù)后2周開(kāi)始，組織學(xué)見(jiàn)血管和平滑肌逐漸增多；至8、12周