維生素D及其受體在角膜上皮細(xì)胞抗真菌免疫中的作用和機(jī)制.pdf

1、目的：觀察維生素D受體（Vitamin D receptor，VDR）在人角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)，探索其表達(dá)通路。并進(jìn)一步分析VDR特異性配體維生素D的活性形式1,25(OH)2D3在角膜上皮抗煙曲霉菌（Aspergillus Fumigatus，AF）感染固有免疫過(guò)程中的作用及具體效應(yīng)機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法驗(yàn)證VDR在正常人角膜組織上皮細(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)用SYBR熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)AF刺激永生化人角膜上皮細(xì)胞（

2、human corneal epithelial cells，HCECs）和制作大鼠角膜潰瘍模型后其VDR mRNA水平的表達(dá)變化。加入TLR2受體單克隆抗體和昆布多糖分別抑制TLR2受體和Dectin-1受體后檢測(cè)HCECsVDR mRNA水平的表達(dá)，以探索VDR上游的信號(hào)傳導(dǎo)通路。檢測(cè)1,25(OH)2D3與 VDR作用后在抗真菌免疫過(guò)程中的功能和作用，應(yīng)用外源性1,25(OH)2D3預(yù)處理HCECs12小時(shí)后，分別在mRNA水平和

3、蛋白水平檢測(cè)AF刺激HCECs后TLR2、TLR4、Dectin-1和抗菌肽（cathelicidin antimicrobial peptide，CAMP）表達(dá)水平的變化。同時(shí)，應(yīng)用SYBR熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別在mRNA水平和分泌性蛋白水平下，檢測(cè)下游炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：SYBR熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，VDR在人角膜上皮細(xì)胞mRNA和蛋白水平均有

4、表達(dá)。而且且AF刺激HCECs和大鼠角膜上皮均能使VDR表達(dá)上調(diào)。使用TLR2單克隆抗體處理HCECs半小時(shí)阻斷TLR2受體后，VDR表達(dá)上調(diào)狀態(tài)被明顯逆轉(zhuǎn)（P<0.01）；使用Dectin-1特異性抑制劑昆布多糖預(yù)處理后，VDR表達(dá)沒(méi)有明顯變化。應(yīng)用1,25(OH)2D3預(yù)處理 HCECs12小時(shí)，之后加入 AF刺激，結(jié)果顯示TLR2、TLR4和Dectin-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)較真菌刺激組明顯降低（P<0.01），與此同時(shí)保