維生素D及其受體在角膜上皮細胞抗真菌免疫中的作用和機制.pdf

1、目的：觀察維生素D受體（Vitamin D receptor，VDR）在人角膜上皮細胞中的表達，探索其表達通路。并進一步分析VDR特異性配體維生素D的活性形式1,25(OH)2D3在角膜上皮抗煙曲霉菌（Aspergillus Fumigatus，AF）感染固有免疫過程中的作用及具體效應機制。
　　方法：應用免疫組織化學染色法驗證VDR在正常人角膜組織上皮細胞中的表達。應用SYBR熒光定量PCR技術(shù)檢測AF刺激永生化人角膜上皮細胞（

2、human corneal epithelial cells，HCECs）和制作大鼠角膜潰瘍模型后其VDR mRNA水平的表達變化。加入TLR2受體單克隆抗體和昆布多糖分別抑制TLR2受體和Dectin-1受體后檢測HCECsVDR mRNA水平的表達，以探索VDR上游的信號傳導通路。檢測1,25(OH)2D3與 VDR作用后在抗真菌免疫過程中的功能和作用，應用外源性1,25(OH)2D3預處理HCECs12小時后，分別在mRNA水平和

3、蛋白水平檢測AF刺激HCECs后TLR2、TLR4、Dectin-1和抗菌肽（cathelicidin antimicrobial peptide，CAMP）表達水平的變化。同時，應用SYBR熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分別在mRNA水平和分泌性蛋白水平下，檢測下游炎癥因子IL-1β和IL-6的表達變化情況。
　　結(jié)果：SYBR熒光定量PCR和免疫組織化學染色結(jié)果顯示，VDR在人角膜上皮細胞mRNA和蛋白水平均有

4、表達。而且且AF刺激HCECs和大鼠角膜上皮均能使VDR表達上調(diào)。使用TLR2單克隆抗體處理HCECs半小時阻斷TLR2受體后，VDR表達上調(diào)狀態(tài)被明顯逆轉(zhuǎn)（P<0.01）；使用Dectin-1特異性抑制劑昆布多糖預處理后，VDR表達沒有明顯變化。應用1,25(OH)2D3預處理 HCECs12小時，之后加入 AF刺激，結(jié)果顯示TLR2、TLR4和Dectin-1在mRNA和蛋白水平的表達較真菌刺激組明顯降低（P<0.01），與此同時保