鈣敏感性受體和活性維生素D在鈣磷平衡和骨骼代謝中的相互作用及機(jī)制研究.pdf

1、為了研究鈣敏感性受(CaSR)和活性維生素D[1，25(OH)2D3]在鈣磷平衡和骨骼代謝中的相互作用及機(jī)制，我們建立了CaSR和25羥維生素D-1-α羥化酶[1 α(OH)ase]雙基因敲除[CaSR-/-1α(OH)ase-/-]小鼠模型，比較分析了2周齡CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠與相應(yīng)單基因敲除及野生型(WT)同窩小鼠的表型差異。 與先前的研究結(jié)果一致，約85％的CaSR-/-小鼠在出生后兩周內(nèi)死亡，幸存至

2、兩周者體格小，體重輕，血鈣明顯升高，血磷降低，血甲狀旁腺素(PTH)水平明顯升高，甲狀旁腺肥大。兩周齡1 α(OH)ase-/-小鼠表現(xiàn)為輕度低鈣低磷血癥，血PTH升高50％，甲狀旁腺中度肥大，但能存活到成年。CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠生存期較CaSR-/-小鼠延長(zhǎng)，2周和4周齡CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠生存率分別為91％和42％。2周齡CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠體重較CaSR-/-小鼠明

3、顯增加，血鈣正常，血磷較CaSR-/-和1α(OH)ase-/-小鼠低，血PTH水平較CaSR-/-小鼠更高。這些結(jié)果說(shuō)明，1α(OH)ase基因敲除能通過(guò)糾正CaSR-/-小鼠的高鈣血癥而延長(zhǎng)其存活期，但由于更嚴(yán)重的高PTH血癥致使CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠不能存活至成年。 為了明確CaSR和1,25(OH)2D3在骨骼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的相互作用，我們通過(guò)影像學(xué)和組織學(xué)比較分析了2周齡不同基因型小鼠骨骼的表型差異

4、。CaS-/-小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨骼生長(zhǎng)障礙，包括長(zhǎng)骨短小，鈣化的次級(jí)骨化中心缺如，骨密度降低，但干骺端小梁骨密度增加。1α(OH)ase-/-小鼠長(zhǎng)骨略短，鈣化的骺端較小，骨密度輕度降低。CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠長(zhǎng)骨長(zhǎng)度、皮質(zhì)骨和小梁骨密度均較CaSR-/-小鼠明顯增加。這些結(jié)果說(shuō)明1α(OH)ase基因敲除能夠部分改變CaSR缺失引起的嚴(yán)重的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育。 為了明確CaSR和1，25(OH)2D3在軟骨內(nèi)成骨

5、中的相互作用，我們通過(guò)組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的方法分析比較了2周齡不同基因型小鼠生長(zhǎng)板的表型差異。CaSR-/-小鼠表現(xiàn)為次級(jí)骨化中心形成延遲，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽(yáng)性軟骨細(xì)胞減少，軟骨細(xì)胞肥大帶明顯增寬。1 α(OH)ase-/-小鼠生長(zhǎng)板和肥大帶寬度較WT小鼠稍有增寬。在2周齡CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠，次級(jí)骨化中心已開(kāi)始形成，肥大軟骨細(xì)胞中已開(kāi)始出現(xiàn)血管和成骨細(xì)胞。生長(zhǎng)板和肥大帶寬度較CaSR-/-小鼠明顯變窄

6、，而PCNA陽(yáng)性軟骨細(xì)胞則較CaSR-/-小鼠明顯增加。鑒于甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(PTHrP)在軟骨細(xì)胞增殖和分化中起有重要作用，我們通過(guò)PTHrP免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)PTHrP陽(yáng)性細(xì)胞在CaSR-/-小鼠明顯減少，而在CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠則較CaSR-/-小鼠有所增加，但沒(méi)有達(dá)到WT小鼠的水平。這些結(jié)果說(shuō)明，1 α(OH)ase基因敲除能夠通過(guò)上調(diào)PTHrP，增加軟骨細(xì)胞的增殖而起到部分糾正CaSR缺失引起的軟骨內(nèi)

7、成骨的嚴(yán)重障礙。 為了明確CaSR和1，25(OH)2D3在骨形成和骨吸收中的相互作用，我們通過(guò)組織學(xué)，組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)及圖像分析檢測(cè)了兩周齡不同基因型小鼠骨組織的表型差異。與WT小鼠相比，成骨細(xì)胞數(shù)、小梁骨容量和骨鈣素(OCN)陽(yáng)性面積在CaSR-/-小鼠均明顯增加；在1α(OH)ase-/-小鼠則有所減少，而在CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠增加更為明顯?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRAP)陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)在CaSR

8、-/-小鼠增加，在1α(OH)ase-/-小鼠減少；而在CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠與WT小鼠相似。NF-kB受體活化素配體(receptoractivatior of NF-kB ligand，RANKL)陽(yáng)性細(xì)胞和面積變化與成骨細(xì)胞的變化一致。這些結(jié)果說(shuō)明，CaSR缺失引起的成骨細(xì)胞骨形成增加是由于PTH過(guò)代償作用的結(jié)果。 本研究進(jìn)一步闡述了CaSR和1,25(OH)2D3在調(diào)節(jié)鈣磷平衡，甲狀旁腺細(xì)胞生長(zhǎng)和PT