輔酶Q-,10-納米脂質體的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、輔酶Q<,10>(coenzyme Q<,10>,CoQ<,10>)是一種人體自行合成的苯醌化合物,可通過電子傳遞鏈加速產生三磷酸腺苷(ATP),同時也是人體細胞膜中廣泛存在的唯一內源親脂性抗氧化劑,它對延緩衰老、提高機體免疫力有著特殊的意義。但CoQ<,10>不溶于水、口服生物利用度低,這一特性極大地限制了它的應用。以納米脂質體作為輸送系統(tǒng)是改善CoQ<,10>等親脂性營養(yǎng)物的水溶性并提高其口服生物利用度的可能途徑。 本論文系

2、統(tǒng)研究了納米脂質體中CoQ<,10>的分析方法、CoQ<,10>納米脂質體的制備工藝和配方、貯存穩(wěn)定性,探討了CoQ<,10>納米脂質體的穩(wěn)定機理;以Caco-2細胞為小腸吸收模型,研究了納米脂質體對CoQ<,10>在攝取及轉運過程中的作用,并進一步研究了CoQ<,10>納米脂質體的大鼠口服吸收動力學。 首先,建立了分析納米脂質體中CoQ<,10>總量的吐溫80增溶-紫外分光光度法。非離子表面活性劑吐溫80作為增溶劑可將包埋在納

3、米脂質體雙分子層中的CoQ<,10>有效釋放,溶質CoQ<,10>的表觀溶解度與吐溫80的濃度呈正相關,增溶CoQ<,10>納米脂質體的較佳吐溫80濃度為1%(w/v)。紫外分光光度法測定經吐溫80增溶的納米脂質體體系中CoQ<,10>含量時,還原劑硼氫化鈉(7 mg/mL)的用量為1 mL,反應時間為40~50 min。采用紫外分光光度法對CoQ<,10>進行定量檢測與高效液相色譜法在2.5~50μg/mL 的CoQ<,10>濃度范圍

4、內具有良好的相關性(R<'2>>0.999)。與傳統(tǒng)的混合溶劑(甲醇/正己烷)萃取-紫外分光光度法相比,吐溫80增溶-紫外分光光度法在保證準確性和重現(xiàn)性的基礎上,具有省去繁瑣耗時的溶劑萃取預處理過程、避免使用有毒有機溶劑的優(yōu)點,為納米脂質體中CoQ<,10>總量的測定提供了一種新方法。 通過比較納米脂質體中CoQ<,10>的包封率及其產品的穩(wěn)定性,確定采用乙醇注入-超聲法在實驗室規(guī)模制備CoQ<,10>納米脂質體。以包封率、保留

5、率、平均粒徑以及平均粒徑變化率為指標,經優(yōu)化得到的較佳制備工藝參數(shù)為:乙醇2 mL,攪拌時間20 min,水化溫度55℃,超聲功率400 W。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到的CoQ<,10>納米脂質體的較佳配方為:蛋黃磷脂/膽固醇/吐溫80/CoQ<,10>(2.5:0.4:1.8:1.2,w/w),水化介質為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4,0.15 mol/L NaCl)。該條件下制得的脂質體絕大部分在20~300

6、nm之間,平均粒徑約76 nm,包封率高于95%,4℃下貯存6個月后,平均粒徑仍在100 urn以下,保留率高于90%。放大試驗證實,實驗室選定的工藝和配方合理,所得產品性質較穩(wěn)定,具有一定的重現(xiàn)性。 在乙醇注入-超聲法制備納米脂質體的過程中,芯材CoQ<,10>的存在有效抑制了脂質體體系中丙二醛的生成。在低溫貯存過程中,CoQ<,10>納米脂質體的穩(wěn)定性與CoQ<,10>的載量相關,CoQ<,10>的載入不僅顯著抑制了體系中丙

7、二醛的產生,而且有效減緩了脂質體平均粒徑的增加。當載量高于20%(w/w)時,CoQ<,10>納米脂質體在經低溫避光貯存6個月后,平均粒徑仍在100 nm以下,同時,保留率在90%以上。CoQ<,10>納米脂質體在模擬胃腸液中具有良好的穩(wěn)定性。與CoQ<,10>混懸液相比,以納米脂質體作為載體可顯著改善CoQ<,10>的抗脂質體過氧化能力和還原能力。通過采用熒光探針、拉曼光譜等手段研究了CoQ<,10>與構成脂質體雙分子層的脂質分子的相

8、互作用,探討了CoQ<,10>納米脂質體穩(wěn)定性機理:納米脂質體雙分子層的流動性與CoQ<,10>的載量密切相關。CoQ<,10>的載入顯著提高了脂質體雙分子層的微粘度,增強了構成脂質體雙分子層的脂質分子之間排列的橫向有序性,降低了脂質體雙分子層的流動性,因而保持了貯存過程中CoQ<,10>納米脂質體的穩(wěn)定性。 建立了Caco-2細胞攝取和轉運模型。結果表明,Caco-2細胞經過21天培養(yǎng)分化后,在形態(tài)上與小腸上皮細胞相似,甘露醇

9、通透率小于0.5%/h,跨膜電阻大于600 Ω·cm<'2>,細胞產生極性分化,符合轉運實驗的要求,可以作為研究CoQ<,10>納米脂質體小腸吸收轉運的體外實驗模型。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法研究了納米脂質體的細胞毒性,結果表明,當納米脂質體的稀釋倍數(shù)為10倍時,在37℃下孵育4 h后,Caco-2細胞存活率高于90%。 CoQ<,10>納米脂質體在Caco-2細胞模型中的攝取研究結果表明:細胞對納米脂質體中CoQ<,10>

10、的攝取量對時間未表現(xiàn)出明顯的依賴性;但細胞攝取量與CoQ<,10>濃度呈顯著相關,低濃度時呈非線性遞增,高濃度下達到飽和,預示了CoQ<,10>的攝取過程中有載體介導參與;也與輔助壁材Tween 80在脂質體壁材中所占的比例有關;在相同的CoQ<,10>濃度水平下,細胞對納米脂質體中CoQ<,10>的攝取量與國外乳狀液產品相比沒有顯著差異。 CoQ<,10>納米脂質體在Caco-2細胞模型中的轉運研究結果表明:(1)與CoQ<,

11、10>混懸液以及國外乳狀液產品相比,采用納米脂質體作為CoQ<,10>的輸送系統(tǒng),顯著促進了CoQ<,10>經Caco-2細胞單層模型的轉運吸收,表觀滲透系數(shù)P<,app>增加為(4.19±0.76)×10<'-6>cm/sec,大于一般認為腸道吸收良好物質的P<,app>(1×10<'-6>cm/sec):(2)納米脂質體中CoQ<,10>經Caco-2細胞膜轉運機制類似兼有被動擴散和載體介導;(3)采用納米脂質體輸送CoQ<,10>

12、可降低或掩蓋肽轉運體以及有機陽離子轉運體對CoQ<,10>跨膜轉運的調節(jié)作用,不過仍然存在P-糖蛋白外排泵參與:(4)CoQ<,10>經Caco-2細胞單層模型轉運的過程中存在生物還原反應,在供給室和接受室中的輔酶Q<,10>均是以原型(氧化型的泛醌CoQ<,10>)存在,Caco-2細胞中蓄積的輔酶Q<,10>約有75mol%被還原為泛醇(CoQ<,10>H<,2>)。 通過熒光法從細胞分子水平研究了納米脂質體輸送系統(tǒng)對Cac

13、o-2細胞膜流動性和P-糖蛋白的影響。結果表明,不同稀釋倍數(shù)的納米脂質體均能顯著影響Caco-2細胞膜的流動性,并且其作用與稀釋倍數(shù)具有一定的相關性。納米脂質體中吐溫80的存在能夠顯著抑制P-糖蛋白的外排作用,提高P-糖蛋白作用底物羅丹明-123的細胞蓄積,該作用與吐溫80的濃度呈正相關。 大鼠分別以30 mg/kg的劑量灌胃給予CoQ<,10>混懸液(0.5%CMC-Na)、乳狀液(國外產品)和納米脂質體后,T<,max>分別

14、為(2.50±0.58)、(2.00±0.71)和(1.00±0.00)h,C<,max>分別(0.25±0.10)、(0.39±0.14)和(0.44±0.06)μg/mL,AUC<,0~12>h分別為(2.09±0.29)、(2.52±0.66)和(2.76±0.87)μg·mL<'-1>·h。與CoQ<,10>混懸液以及乳狀液相比,以納米脂質體作為CoQ<,10>的輸送系統(tǒng)經口服具有吸收快的優(yōu)點。以CoQ<,10>的混懸液為對照,

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