氚照射對大鼠神經(jīng)元遷移相關(guān)因子表達(dá)及學(xué)習(xí)記憶功能的影響.pdf

1、目的：本研究以氚水（HTO）處理體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞建立細(xì)胞受照模型，孕鼠腹腔單次注射氚水建立胎鼠體內(nèi)照射模型，觀察不同濃度氚水照射條件下體外培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞遷移距離的變化，大鼠神經(jīng)細(xì)胞遷移相關(guān)因子如細(xì)胞骨架蛋白（F-actin,α-tubulin,tau,MAP2）、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(L1,NCAM)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF mRNA和細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白ReelinmRNA的表達(dá)情況；通過Morris水迷宮實驗分析受照仔鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

2、受損情況，從而探討氚輻射對神經(jīng)細(xì)胞遷移及大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　方法：
　　(1)神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)出生后1天新生鼠，在無菌條件下取海馬，制備1.25×106/ml神經(jīng)細(xì)胞懸液，加入含DMEM/F12(1:1)和B27的培養(yǎng)基中，放置于37℃,5％CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中。
　　(2)阿糖胞苷處理及細(xì)胞分組神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第3天后加入終濃度為3ug/ml的阿糖胞苷作用24小時。培養(yǎng)第7天，以0,3.7×102,3.7

3、×103,3.7×104,3.7×105,3.7×106Bq/ml濃度氚水照射神經(jīng)細(xì)胞，照射24h。
　　(3)神經(jīng)細(xì)胞遷移距離測定以Leica AF6000活細(xì)胞工作站測受照神經(jīng)細(xì)胞遷移的距離,活細(xì)胞工作站儀器可以自動聚焦，進(jìn)行單細(xì)胞追蹤，連續(xù)監(jiān)測8小時，結(jié)果使用LAS-AF-Lite2.3.0軟件分析。
　　(4)拉曼光譜分析神經(jīng)細(xì)胞蛋白表達(dá)情況使用XploRA拉曼光譜分析儀在532nm波長激光激發(fā)下光鏡觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白表

4、達(dá)分布情況，結(jié)果使用Image-Pro Plus(IPP)軟件進(jìn)行分析。
　　(5)實驗動物分組及模型制備Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體重(180-240)g，以雌雄(2:1)的比例隨機進(jìn)行配對合籠，每日8:00觀察陰栓。將發(fā)現(xiàn)陰栓日定為胚胎第0天(E0)，仔鼠出生當(dāng)日定為出生后第0天(P0)。在胚胎發(fā)育第14天(E14)將孕鼠隨機分為實驗和對照兩組(每組各10只),實驗組孕鼠單次腹腔注射濃度為3.7×106B

5、q/g體液的氚水，對照鼠注射等體積的生理鹽水。
　　(6)仔鼠腦組織標(biāo)本制備于胚胎發(fā)育第18天（E18），每組各選取3只孕鼠，每只大鼠經(jīng)剖腹手術(shù)各取6只胎鼠。出生后當(dāng)天（P0）每組分別處死18只仔鼠，開顱取腦，將腦組織放置在含4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液中浸泡固定24小時后切除小腦，使用梯度濃度的乙醇進(jìn)行脫水，石蠟進(jìn)行包埋。
　　(7)免疫組織化學(xué)染色用EnVision法檢測E18胎鼠和P0仔鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞F-actin,α-

6、tubulin,tau，MAP2蛋白的表達(dá)情況。
　　(8)Western blot檢測神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白(F-actin,α-tubulin,tau，MAP2)及神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(L1、NCAM)的表達(dá)情況。以Quantity-One生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行目的條帶半定量分析,各條帶累積光密度(Integral Optical Density，IOD)值除以β-actin的IOD值，通過比較各受照組相對強度(relative in

7、tensity,RI)值觀察蛋白表達(dá)的變化情況。
　　(9)RT-PCR半定量檢測細(xì)胞內(nèi)BDNF mRNA及Reelin mRNA表達(dá)，以Quantity-One生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析,將各樣品條帶IOD值除以β-actin的IOD值,通過比較各受照組相對強度(relative intensity,RI)值觀察蛋白表達(dá)的變化情況。
　　(10)Morris水迷宮測量仔鼠腦機能出生后38-42天（P38-P42），

8、利用Morris水迷宮進(jìn)行定向航行訓(xùn)練和空間探索實驗,測逃避潛伏期和目標(biāo)象限停留時間以及目標(biāo)象限穿行次數(shù),了解仔鼠學(xué)習(xí)和記憶能力,分析氚輻射對仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)第7天神經(jīng)元細(xì)胞較第3天的胞體飽滿，立體感強，折光性好、光暈明顯，細(xì)胞與細(xì)胞之間突起聯(lián)系更為緊密，胞體及突起表面平滑。
　　(2)遷移距離測定結(jié)果顯示，受0～3.7×106Bq/mL濃度氚水照射24小時，神經(jīng)細(xì)胞

9、的遷移距離呈現(xiàn)出濃度依賴性減小，受照細(xì)胞遷移距離明顯小于對照（p<0.05）。
　　(3)Western blot結(jié)果顯示，隨著氚水濃度的逐漸增大F-actin，α-tubulin，tau，MAP2，NCAM，L1的表達(dá)逐漸減弱(P＜0.05)。
　　(4)RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度氚水照射24h后，BDNFmRNA和Reelin mRNA表達(dá)量隨著氚水濃度的不斷增大而逐漸減少。
　　(5)拉曼光譜結(jié)果顯示，隨著氚

10、水濃度的逐漸增大，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白信號強度逐漸減弱。
　　(6)免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明，與對照比，E18及P0實驗組大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白F-actin,α-tubulin,tau，MAP2表達(dá)量均降低(P<0.05)。
　　(7)Morris水迷宮實驗證實，受照鼠逃避潛伏期較對照鼠明顯延長(P<0.05)，而其在目標(biāo)象限停留時間及目標(biāo)象限穿行次數(shù)明顯少于對照(P<0.05)，說明氚宮內(nèi)照射后仔鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力較對