氚β輻射對神經(jīng)細胞遷移相關(guān)因子表達的影響.pdf

1、目的:本研究用氛水(HTO)處理離體培養(yǎng)的神經(jīng)細胞，觀察其遷移距離改變及細胞遷移相關(guān)因子如細胞內(nèi)游離鈣離子含量、微管蛋白β-tubulin和神經(jīng)細胞粘附分子(NCAM)以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) mRNA表達的變化，探討氛R射線照射對神經(jīng)元細胞遷移的影響。
　　方法:(1)神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)體外分離神經(jīng)細胞，用DMEM/F12培基(含10％胎牛血清、2%B27, 20μg/mLbFGF與20 μ g/mLEGF)，于37℃,

2、 5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng);
　　(2)阿糖胞普處理接種第3天加入終濃度為5 u mol/L Ara-c作用48h，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖，提高神經(jīng)元細胞純度;
　　(3) HTO β射線照射以0、3.7 × 10s, 3.7×104, 3.7×105與3.7×106Bq/ml的HTO處理原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞;
　　(4)細胞遷移距離測定于照射24h后用Leica AF 6000活細胞工作站測神經(jīng)細胞遷移的距離

3、，連續(xù)監(jiān)測8小時，并用LAS-AF-Lite 2.3.0軟件分析;
　　(5)Western blot法檢測神經(jīng)細胞內(nèi)微管和NCAM蛋白表達情況。
　　(6)免疫細胞化學法觀察神經(jīng)細胞內(nèi)微管和NCAM蛋白表達情況。
　　(7)半定量RT-PCR法檢測細胞內(nèi)BDNF基因mRNA表達。以Bandscan軟件進行半定量分析，將各樣品條帶灰度值除以GAPDH的灰度值，得到一相對強度(relativeintensity, RI)

4、，比較受照各組R工值以分析基因表達的變化規(guī)律。
　　(8)細胞內(nèi)游離鈣離子濃度測定0.25%胰酶消化，將神經(jīng)元細胞制備成單細胞懸液，用Fluo-3-AM熒光探針負載、流式細胞儀測定神經(jīng)細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，隨機測定單個神經(jīng)元的熒光強度值，取神經(jīng)元熒光強度值的平均值為各組測定值。結(jié)果以專用的分析軟件WinMDI2. 9分析處理，熒光強度的大小來可反映細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的相對大小。
　　(9)統(tǒng)計學分析所測數(shù)據(jù)用(x)±s表示

5、，采用SPSS(13. 0)軟件進行統(tǒng)計學處理，組間差異比較采用兩獨立樣本t檢驗,用多元直線回歸分析數(shù)據(jù)變量間依存關(guān)系。
　　結(jié)果:(1)倒置顯微鏡下觀察，對照組神經(jīng)元細胞體飽滿，立體感強，折光性好且光暈明顯，細胞之間建立突起聯(lián)系，胞體及突起表面平滑。受照細胞折光性差,胞體欠飽滿,細胞皺縮,突起消失,變圓,粘附力下降。
　　(2)遷移距離測定結(jié)果顯示,受0-3.7×106 Bq/mL氚水照射24h,神經(jīng)細胞的遷移距離呈劑量依

6、賴性減小,受照細胞遷移距離均明顯小于對照(p<0.05)。
　　(3)免疫細胞化學和western blot結(jié)果顯示,隨著氚水照射劑量的增大,β-tubulin和NCAM表達逐漸減弱(P<0.05)。
　　(4)RT-PCR結(jié)果顯示,不同濃度HTO照射24h后,BDNF基因mRNA表達量隨著HTO濃度增大而減少。
　　(5)細胞流式檢測結(jié)果表明,隨氚水照射劑量的增大,細胞內(nèi)熒光逐步增強,且熒光強度的增加與照射劑量之間呈