PI3K-Akt-mTOR通路抑制劑影響乳腺癌干細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療和靶向治療耐藥性的研究.pdf

1、目的:
　　研究抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中PI3K對(duì)乳腺癌干細(xì)胞(breast cancerstem cells，BCSCs)的作用及其對(duì)內(nèi)分泌藥物敏感性的影響;研究抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中mTOR表達(dá)對(duì)曲妥珠單抗耐藥的BCSCs的作用及對(duì)靶向治療藥物敏感性的影響。
　　方法:
　　1.采用無血清培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)球囊細(xì)胞的方法富集乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的BCSCs，使用流式儀分選出ESA＋

2、CD44＋CD24-/low亞群，并對(duì)其進(jìn)行克隆培養(yǎng)。構(gòu)建表達(dá)芳香化酶CYP19的真核表達(dá)載體（pHβ-Aro-CYP19），分別轉(zhuǎn)染MCF-7中的BCSCs和非干細(xì)胞，從而獲得高表達(dá)芳香化酶的BCSCs(BCSCs-CYP19)和非干細(xì)胞（MCF-7-CYP19）亞克隆。通過MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖、劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞克隆形成能力，比較單用PI3K靶向抑制劑BKM120及其聯(lián)合

3、內(nèi)分泌治療藥物來曲唑?qū)CSCs-CYP19和MCF-7-CYP19的抑制作用的影響。利用Western blot檢測(cè)單藥BKM120或聯(lián)合來曲唑用藥對(duì)PI3 K/Akt/mTOR通路中AKT1、PI3K、S6的蛋白表達(dá)水平的影響。
　　2.通過使用不同濃度的曲妥珠單抗持續(xù)作用BT4746個(gè)月得到曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞BT474R，并通過MTT試驗(yàn)證實(shí)BT474R構(gòu)建成功。采用無血清培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)球囊細(xì)胞的方法富集BT474和BT47

4、4R中的BCSCs，使用流式儀分選出ESA＋CD44＋CD24-/low的BCSCs亞群，并對(duì)其進(jìn)行克隆培養(yǎng)。利用WesternBlot檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR通路中PI3K、AKT1、S6、mTOR蛋白表達(dá)水平的改變，評(píng)價(jià)該通路在曲妥珠單抗耐藥過程中的作用影響。沉默BCSCs-BT474R中的mTOR，通過平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力;利用Western Blot檢測(cè)下調(diào)mTOR表達(dá)后的BT474R干細(xì)胞中PI3K、AKT1

5、、S6、mTOR蛋白表達(dá)水平的改變，評(píng)價(jià)下調(diào)mTOR對(duì)BT474R-BCSCs的抑制作用。通過MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖、平板克隆實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞克隆形成能力，比較單用聯(lián)合mTOR抑制劑依維莫司和靶向治療藥物曲妥珠單抗對(duì)BT474R-BCSCs的抑制作用的影響。
　　結(jié)果:
　　1.BKM120對(duì)BCSCs-CYP19和MCF-7-CYP19的作用:與對(duì)照組相比，BKM120對(duì)MCF-7-CYP19及BCSCs-CYP19生長(zhǎng)均具有抑制

6、作用，抑制作用呈劑量依賴性。BKM120可降低BCSCs-CYP19的遷移能力、克隆形成能力和球囊形成能力。BKM120可顯著降低BCSCs-CYP19中PI3K、AKT1、S6的蛋白表達(dá)水平。
　　2.BKM120聯(lián)合來曲唑?qū)CF-7-CYP19及BCSCs-CYP19的作用:聯(lián)合應(yīng)用BKM120與來曲唑可抑制BCSCs-CYP19的克隆形成能力， G0-G1期細(xì)胞滯留比例增加，可誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，下調(diào)BCSCs-CYP19中

7、PI3K、AKT1、S6的蛋白表達(dá)。
　　3.PI3K/Akt/mTOR通路在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中處于激活狀態(tài);沉默BT474R-BCSCs的mTOR，BT474R-BCSCs對(duì)曲妥珠單抗的抵抗作用降低，位于mTOR上游的蛋白的表達(dá)無顯著變化，而mTOR表達(dá)及其下游的S6蛋白磷酸化顯著降低。證實(shí)PI3K/Akt通路下游分子mTOR在曲妥珠單抗耐藥中發(fā)揮重要作用。
　　4.mTOR抑制劑依維莫司可有效抑制BT474R-BCSC

8、s的生長(zhǎng)和體外克隆形成能力，其聯(lián)合曲妥珠單抗抑制BT474R-BCSCs生長(zhǎng)的作用更強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.PI3K抑制劑BKM120可抑制內(nèi)分泌治療耐藥的BCSCs，BKM120聯(lián)合來曲唑較單藥可更有效的抑制內(nèi)分泌治療耐藥的BCSCs并下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路中重要下游產(chǎn)物的表達(dá)，在逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.PI3K/Akt/mTOR通路在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中處于激活狀態(tài)