胃癌血清蛋白質(zhì)組定量分析及建立差異蛋白決策樹模型的質(zhì)譜研究.pdf

1、研究目的： 利用SELDI飛行質(zhì)譜與蛋白芯片技術(shù),建立有針對性的胃癌分類決策樹模型,用于對胃癌的早期診斷、鑒別及預(yù)后判斷。利用2-D DIGE技術(shù)和MALDITOF/TOF MS對胃癌、胃潰瘍和正常人血清中的差異蛋白進行分離鑒定,尋找潛在的腫瘤標記物。 研究內(nèi)容: 第一部分 胃癌患者血清的比較蛋白質(zhì)組研究 實驗一主要是建立胃癌的診斷模型。將所收集的血清樣本包括123例胃癌患者,74例胃良性病,83例正常

2、人血清,分為訓(xùn)練組和盲法測試組。隨機選取胃癌組血清標本20例,良性胃病13例和正常人血清10例用于盲法驗證,其余標本作為訓(xùn)練組。 訓(xùn)練組中胃癌103例,對照組134例(良性胃病61例和正常人血清73例)用以建立分類決策樹模型1;將Ⅰ期胃癌20例,對照組73例(正常人)用以建立分類決策樹模型2;將Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ胃癌77例,對照組61例(良性胃病)用以建立分類決策樹模型3。 用表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)建立每例樣本的蛋

3、白表達譜,通過BioMarker Wizard統(tǒng)計軟件,對各組相同M/Z的蛋白質(zhì)相對含量進行計算,從而篩選出血清差異蛋白。用Biomarker Pattern數(shù)據(jù)挖掘軟件建立分類決策樹模型。 將盲法測試組中樣本分別帶入上述決策樹模型進行判別,同時檢測CEA和CA19-9水平。 實驗二對不同分期胃癌蛋白質(zhì)組進行比較。將Ⅰ期胃癌20例,對照組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ胃癌77例用以建立分類決策樹模型4;將Ⅳ期胃癌18例,對照組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胃癌

4、79例用以建立分類決策樹5。將實驗一盲法驗證組中有明確分期的18例胃癌血清標本分別帶入分類決策樹4和分類決策樹5,用于盲法驗證：將10例術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的血清帶入分類決策樹5,觀察它診斷胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的能力； 第二部分 胃癌患者血清的定量蛋白質(zhì)組研究 收集年齡與性別相匹配的進展期胃腺癌、良性胃潰瘍和正常人三組血清樣本,每組各9例。利用層析柱去除高峰度蛋白,用改進Bradford法蛋白定量。經(jīng)過預(yù)實驗優(yōu)化實驗條件,將每組血

5、清樣本混合后分別與Cy3、Cy5染料結(jié)合,內(nèi)標為每兩組間半量樣品混合液與Cy2結(jié)合。一向等電聚焦和第二向SDS-PAGE后,用Typhoon9410掃描儀在488/520nm,532/580nm,633/670nm波長分別對Cy2,Cy3,Cy5熒光染料標記的三塊膠圖像進行掃描,掃描儀收集的數(shù)據(jù)由DeCyder軟件和人工分析結(jié)合,比較并發(fā)現(xiàn)兩組之間的差異蛋白。重新制備膠雙向電泳、考染并掃描后所得到的膠圖與2-D DIGE圖像對比,找到制

6、備膠上對應(yīng)的差異點,酶切后采用肽序列標簽法對這些差異蛋白進一步進行鑒定。 研究結(jié)果: 第一部分 1.檢測103例胃癌患者、對照組61例良性胃病患者和73例正常人血清中的差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進行分組,建立了以20個差異蛋白組成的分類樹模型1,在測試模式下進行分組,對胃癌診斷的靈敏度和特異性分別為78.6％(81/103)、80.6％(108/134)。利用43例未知血清樣本進行盲法檢測,對胃癌診斷的敏感性為80.

7、0％,特異性為78.2％,3例I期胃癌中有1例被檢出。敏感性指標優(yōu)于同組樣本的CEA和CA19-9檢測結(jié)果。 2.檢測20例I期胃癌,73例正常人血清中的差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進行分組,建立了以2個差異蛋白組成的分類樹模型2;在測試模式下進行分組,對I期胃癌診斷的靈敏度和特異性分別為95.0％(19/20)、89.0％(65/73)。盲法檢測26例未知血清樣本,3例I期胃癌全部被檢出。 3.檢測77例II、II、IV期胃

8、癌患者與61例良性胃病患者,在學(xué)習(xí)模式下進行分組,建立了以9個差異蛋白組成的分類決策樹模型3。在測試模式下進行分組,對胃癌診斷的靈敏度和特異性分別為84.4％(65/77)、73.8％(45/61)。對28例未知血清樣本(II、Ⅲ和IV期胃癌和良性胃病)進行盲法檢測,對胃癌診斷的敏感性為80.0％,特異性為69.2％。 4.檢測20例I期與77例II、Ⅲ、IV期胃癌患者血清差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進行分組,建立了5個差異蛋白組成的

9、分類決策樹模型4,在測試模式下對上述樣本進行分組,其準確率為91.8％(89/97)。對18例未知血清樣本進行盲法檢測,其分組的準確率為83.3％。 5.檢測79例I、II、Ⅲ期與18例IV期胃癌患者血清差異蛋白,在學(xué)習(xí)模式下進行分組,建立了以6個差異蛋白組成的分類決策樹模型5,在測試模式下對上述樣本進行分組,其準確率為92.8％(90/97)。對18例未知血清樣本進行盲法檢測,其分組的準確率為88.9％。對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的10例

10、血清樣本進行盲法檢測,9例被判別為IV期胃癌。 第二部分 胃癌、胃潰瘍和正常人三組樣品兩兩比較,共發(fā)現(xiàn)14個差異表達的蛋白質(zhì)。成功鑒定了其中的9個蛋白質(zhì)。正常人和胃潰瘍兩組中有三個在胃潰瘍患者的血清中低表達的蛋白質(zhì),兩個蛋白被鑒定,包括結(jié)合珠蛋白2-α和一種未命名蛋白質(zhì)；胃潰瘍和胃癌兩組中發(fā)現(xiàn)一個下調(diào)的差異蛋白質(zhì):RAN結(jié)合蛋白2樣因子1亞型1(RAN-binding protein 2-like 1 isoform 1

11、);在胃癌與正常人兩組中共有10個蛋白質(zhì)差異點,在胃癌患者血清中上調(diào)的有6個,下調(diào)的有4個。成功鑒定了6個蛋白質(zhì)。四種蛋白質(zhì),包括血清類粘蛋白1、載脂蛋白前體、肉豆蔻酸和三碘苯甲酸人血清白蛋白復(fù)合物和肉豆蔻酸人血清白蛋白復(fù)合物在胃癌血清中高表達。視黃醛及其載體TTR復(fù)合物的D鏈和一個未命名蛋白質(zhì)在胃癌血清中低表達。 結(jié)論: 1.成功獲得了以IMAC30 Cu2+固定金屬親合捕獲蛋白芯片和SELDI TOF-MS為基礎(chǔ)的胃

12、癌血清蛋白質(zhì)譜圖并由此建立了相關(guān)的分類決策樹模型, 2.交叉驗證和盲法檢測結(jié)果表明所建立的模型具有較好的靈敏度和特異性,有助于胃癌的診斷,分期,術(shù)后復(fù)發(fā)的檢測。 3.建立有較強針對性的胃癌血清蛋白質(zhì)譜決策樹模型可以提高診斷的準確性。 4、與傳統(tǒng)標記物相比,SELDI TOF-MS技術(shù)在胃癌的診斷及篩選腫瘤標志物等方面具有一定的優(yōu)勢。 5.利用2-D DIGE技術(shù)和MALDI TOF/TOF MS,成功的鑒