小鼠盲腸結(jié)扎穿孔模型血漿蛋白質(zhì)組變化的初步研究.pdf

1、研究目的1.建立血漿蛋白質(zhì)組研究平臺(tái)，掌握去除小鼠血漿白蛋白的方法以及進(jìn)行血漿2-DE所需要的各種條件。2.了解CLP術(shù)后不同時(shí)間段小鼠血漿蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究方法1.應(yīng)用SDS-PAGE、2-DE及膠圖分析軟件對(duì)各種條件下去除血漿白蛋白的效果做出評(píng)價(jià)，從中選擇最佳方案。2.制備盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)動(dòng)物模型，假手術(shù)組只游離盲腸、不做結(jié)扎及穿孔作為對(duì)照組。在術(shù)后不同的時(shí)間點(diǎn)抽取血液，去

2、除血漿中的白蛋白后，再行2-DE。同組相同時(shí)間點(diǎn)的5個(gè)個(gè)體膠圖做一個(gè)虛擬平均膠，然后將同一時(shí)間點(diǎn)的CLP組與假手術(shù)組的虛擬平均膠匹配，再到個(gè)體膠圖中比對(duì)，確認(rèn)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，對(duì)其行膠內(nèi)消化、MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。 研究結(jié)果1.使用DEAE-CibacronBlue3GA可去除80％的血漿白蛋白。去除白蛋白后，2-DE顯示的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)由處理前的211±19個(gè)增加到392±11個(gè)，而且許多斑點(diǎn)的蛋白質(zhì)表達(dá)量

3、也明顯增加，并可發(fā)現(xiàn)更多的差異點(diǎn)。同一個(gè)體的平行膠圖的平行性、可重復(fù)性滿意，顯示的蛋白斑點(diǎn)在分布、表達(dá)量和染色、背景等方面基本一致。2.虛擬平均膠匹配分析發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后4h，CLP組與假手術(shù)組有43個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)未能匹配，但將這些差異點(diǎn)在個(gè)體膠中分析，均未能在4對(duì)以上的膠圖中出現(xiàn)。3.使用虛擬平均膠匹配分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后24h時(shí)CLP組與假手術(shù)組共有122個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)未能匹配；在個(gè)體膠中加以分析后，證實(shí)CLP組較假手術(shù)組有39個(gè)斑點(diǎn)上調(diào)，其中1

4、8個(gè)為新出現(xiàn)的；CLP組中無下調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。經(jīng)膠內(nèi)消化、質(zhì)譜鑒定、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索發(fā)現(xiàn)，有33個(gè)斑點(diǎn)得到鑒定，分屬于8種蛋白質(zhì)：補(bǔ)體C3、富亮氨酸α2糖蛋白、低分子量激肽原、α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白P、血紅素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白。 4.術(shù)后24h小鼠血漿中有一組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)表達(dá)量較術(shù)后4h時(shí)明顯增加，共有4個(gè)斑點(diǎn)，呈串珠樣排列，但在24hCLP組與假手術(shù)組之間無差異，經(jīng)鑒定，這4個(gè)斑點(diǎn)均為結(jié)合珠蛋白。

5、 結(jié)論1.去除小鼠血漿中的白蛋白后，可顯著增加2-DE對(duì)血漿中差異蛋白質(zhì)的顯示能力。2.本研究建立的血漿蛋白質(zhì)組研究平臺(tái)可用于疾病機(jī)制研究。3.小鼠血漿中的結(jié)合珠蛋白只與手術(shù)創(chuàng)傷等炎癥反應(yīng)有關(guān)，而與膿毒癥無關(guān)。4.與假手術(shù)組比較，CLP組手術(shù)后4h小鼠血漿蛋白質(zhì)組無明顯變化。5.與假手術(shù)組比較，CLP組手術(shù)后24h小鼠血漿中高表達(dá)的蛋白質(zhì)有：補(bǔ)體C3、富亮氨酸α2糖蛋白、低分子量激肽原、α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白P、