益生菌Lactobacillus casei Zhang蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、乳酸菌廣泛存在于動(dòng)物、植物及自然環(huán)境中，是同人類生活和生產(chǎn)密切相關(guān)的重要微生物之一。LactobacilluscaseiZhang是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選自內(nèi)蒙地區(qū)、蒙古國(guó)和新疆地區(qū)牧民家庭以傳統(tǒng)方法制作的自然發(fā)酵酸馬奶中，研究表明，該菌株具有許多重要益生性狀和功能，尤其是對(duì)酸和膽鹽具有較強(qiáng)的耐受性，是乳酸菌研究和益生菌開發(fā)利用的理想菌種。 此項(xiàng)研究從蛋白質(zhì)組的水平，對(duì)益生菌L．caseiZha

2、ng在膽鹽和酸脅迫下蛋白質(zhì)差異表達(dá)及其分子機(jī)制進(jìn)行了探討。將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與基因組學(xué)、代謝組學(xué)、傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)等相結(jié)合，為研究乳酸菌對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)、耐受和適應(yīng)機(jī)制，為益生菌分離篩選、開發(fā)推廣，提供了較為全面系統(tǒng)的研究思路。 研究利用液氮研磨法成功分離提取了L．caseiZhang菌體蛋白質(zhì)，系統(tǒng)優(yōu)化了干酪乳桿菌蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術(shù)（2—DE），使之有效地用于干酪乳桿菌雙向凝膠電泳圖譜的構(gòu)建。利用上述方法和技術(shù)，研究首先建立

3、了L．caseiZhang和對(duì)比菌株L．caseiXM2-1在pl4—7范圍內(nèi)不同生長(zhǎng)階段的全蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，并且比較了L．caseiZhang在膽鹽和酸脅迫下差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜。經(jīng)過比較分析，研究利用質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其中差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定、功能分類和代謝途徑分析等。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)某些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的相應(yīng)基因進(jìn)行了mRNA水平的分析與驗(yàn)證。結(jié)果表明： 經(jīng)過對(duì)L．caseiZhang在對(duì)數(shù)生

4、長(zhǎng)期與穩(wěn)定期雙向凝膠電泳圖譜分析顯示，利用優(yōu)化的蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術(shù)可以分離到L．caseiZhang約500個(gè)蛋白點(diǎn)，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI—TOF/MS）鑒定出110種蛋白質(zhì)，并對(duì)蛋白質(zhì)功能、密碼子偏好性、蛋白疏水性等進(jìn)行了分析，從而構(gòu)建了L．caseiZhang的參考雙向凝膠電泳圖譜。 進(jìn)一步比較分析L．caseiZhang對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期的2—DE圖譜表明，47種蛋白質(zhì)在L．caseiZh

5、ang不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)變化明顯，其中33種蛋白質(zhì)在穩(wěn)定期時(shí)的蛋白表達(dá)量比對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增強(qiáng)至少2.5倍，包括Dnak、GroEL、LuxS、PK和GaIU等19種蛋白質(zhì)表達(dá)量增強(qiáng)在3.0倍以上；此外，6種蛋白質(zhì)表達(dá)量在穩(wěn)定期下降2.5倍以上；2種蛋白質(zhì)只在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期表達(dá)；8種蛋白質(zhì)只發(fā)現(xiàn)于穩(wěn)定期圖譜中。根據(jù)功能分類，這些差異蛋白質(zhì)主要為應(yīng)激蛋白及代謝相關(guān)蛋白，可能與L．caseiZhang穩(wěn)定期對(duì)環(huán)境變化具有較強(qiáng)耐受性有密切關(guān)系。同時(shí)，

6、研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其中的8個(gè)差異蛋白質(zhì)，包括DnaK、GroEL、Hsp20-1、Hsp20—2、Galactosemutarotaserelatedenzyme、BetasubunitofpyruvatedehydrogenasecomplexE1componen、UDP—glucosepyrophosphorylase和EsteraseC的相應(yīng)基因進(jìn)行了mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化分析，顯示不同的基因具有的不同表達(dá)模式。而對(duì)

7、比菌株L．caseiXM2-1與L．caseiZhang的雙向凝膠電泳圖譜非常相似，說明了它們是同一種屬，但是存在菌株間差異表達(dá)蛋白質(zhì)。L．caseiXM2-1在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定期雙向凝膠電泳圖譜分析表明，有16種蛋白質(zhì)表達(dá)變化明顯，其中12種蛋白質(zhì)在穩(wěn)定期表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)2倍以上，而有2種蛋白質(zhì)表達(dá)量在穩(wěn)定期下降。 利用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，研究從蛋白質(zhì)組的水平對(duì)L．caseiZhang在膽鹽脅迫下的蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況及其膽

8、鹽耐受機(jī)制進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明，與不含膽鹽正常生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體相比，L．caseiZhang在含有1.5％膽鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，有26種蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了變化，其中包括應(yīng)激蛋白、糖代謝蛋白、肽酶、氨基酸代謝蛋白、轉(zhuǎn)錄蛋白、核糖體蛋白、核酸代謝蛋白和脂肪代謝蛋白等，說明L．caseiZhang應(yīng)對(duì)膽鹽應(yīng)激具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，不是一種或幾種蛋白質(zhì)發(fā)生作用。經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證和短時(shí)間膽鹽脅迫蛋白質(zhì)組研究，其中與

9、應(yīng)激作用、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性及抗氧化等機(jī)制相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)可能在L．caseiZhang耐膽鹽中起到非常重要的作用。此外，在研究中還發(fā)現(xiàn)，GroEL、DnaK、UspA、GalU、NagA、LuxS、EF—Tu和30SribosomalproteinS2等蛋白質(zhì)在L．caseiZhang穩(wěn)定期蛋白質(zhì)組比較中表達(dá)量也增強(qiáng)，也許暗示膽鹽與酸應(yīng)激對(duì)干酪乳桿菌有某些相似的脅迫作用，從而誘導(dǎo)了共同的應(yīng)激機(jī)制。但是，膽鹽和酸脅迫這兩種不同的環(huán)境壓力也可

10、誘導(dǎo)L．caseiZhang產(chǎn)生不同的特異性表達(dá)差異蛋白質(zhì)，也表明了不同脅迫可能對(duì)L．caseiZhang產(chǎn)生不同的影響。 L．caseiZhang和對(duì)比菌株LcaseiXM2-1酸脅迫下生長(zhǎng)蛋白質(zhì)變化結(jié)果顯示，在不同pH值條件下生長(zhǎng)時(shí)，分別有15種和14種蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了變化，主要包括應(yīng)激蛋白、脂酶、翻譯因子等。兩株菌在不同pH值下生長(zhǎng)雖然有相似的蛋白差異點(diǎn)，但也有個(gè)別差異蛋白質(zhì)表現(xiàn)出菌株依賴性，可能是不同菌株在酸脅迫下特異性