中介蝮蛇毒蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project)的完成，生命科學(xué)研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代，其標(biāo)志之一就是蛋白質(zhì)組學(xué)(Pmteomics)的興起。蛋白質(zhì)作為基因功能的直接執(zhí)行者，其在特定細(xì)胞、組織或器官中的表達(dá)模式如何日益引起科學(xué)家們的關(guān)注，蛋白質(zhì)組學(xué)也一躍成為生命科學(xué)的熱點(diǎn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)在揭示疾病的發(fā)病機(jī)理、尋找腫瘤標(biāo)志物及研究藥物的作用機(jī)制等方面已被廣為采用。 蛇毒(Snake venom)是從蛇毒腺中分泌的許

2、多具有藥理學(xué)活性的功能性酶及多肽的復(fù)雜混合物。它可以麻痹和殺死獵物，也是開發(fā)新型藥物的寶貴資源。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，以及蛇毒在蛋白組成方面的相對(duì)簡(jiǎn)單性，蛋白質(zhì)組學(xué)方法在蛇毒研究方面開始暫露頭角。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)相繼有包括游蛇科(Colubridae)、蝰科[響尾蛇亞科(Crotalini)、蝮亞科(Agkistrodontini)]、眼鏡蛇科(Elapidae)在內(nèi)的近70種蛇毒的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道。鑒定出了包括蛇毒金屬蛋白酶(Sn

3、ake venommetalloproteinases，SVMPs)、絲氨酸蛋白酶(Serine proteases)、神經(jīng)毒素(Neurotoxins)、心臟毒素(Cardiotoxins)、富含半胱氨酸的分泌蛋白(Cysteine-richsecretotv proteins)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)、L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase)、緩激肽增強(qiáng)肽(Bradykin

4、in potentiating peptide，BPP)、肌肉毒素(Myotoxin)在內(nèi)的許多有意義的蛋白。這些對(duì)蛇毒組分的方位研究結(jié)果對(duì)于蛇毒的進(jìn)化、中毒治療、抗血清生產(chǎn)及藥物開發(fā)均具有重要意義。 中介蝮(G. Intermedius)是廣泛分布于我國(guó)西北地區(qū)及華北部分地區(qū)的一種毒蛇，也是我國(guó)6種蝮蛇中毒性最大的一種蝮蛇。目前，已有新疆、內(nèi)蒙、青海該蛇為害的報(bào)道。以往關(guān)于中介蝮的形態(tài)、動(dòng)物區(qū)系、食性及生態(tài)、毒液的生物化學(xué)與毒

5、理學(xué)等方面已有研究報(bào)道。然而，至今仍缺乏對(duì)其蛇毒組分的整體研究，這不但妨礙其蛇傷的有效治療，也是限制其開發(fā)利用的一個(gè)瓶頸。為此，本研究擬以采集自陜北的中介蝮蛇毒為材料，運(yùn)用雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)及基質(zhì)輔助激光解離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)對(duì)其蛇毒進(jìn)行了蛋白質(zhì)學(xué)研究。 結(jié)果如下： 1．粗毒中各組分的分子量在94 kDa以內(nèi)，主要分布在約

6、30 kDa-67 kDa、12kDa-14 kDa兩個(gè)范圍，提示在這兩個(gè)分子量區(qū)間內(nèi)的蛋白質(zhì)含量豐富，高豐度表達(dá)。另外，在45.0 kDa～66.2 kDa區(qū)間有中等表達(dá)水平的蛋白分布。 2．粗毒經(jīng)基質(zhì)輔助激光解離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)粗毒中低分子量的組分16個(gè)，分子量分布在1 kDa～15 kDa之間。 3．經(jīng)2-DE聯(lián)合MALDI-TOF MS方法分析，結(jié)合雙向電泳蛋白質(zhì)點(diǎn)的表觀分子

7、量及等電點(diǎn)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，搜索到22個(gè)匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)信息，初步鑒定得到了22種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)主要?dú)w屬于Ⅲ型金屬蛋白酶家族、絲氨酸蛋白酶家族、磷脂酶A<,2>家族成員，此外還有L-氨基酸氧化酶家族成員、CRISP家族成員、以及少數(shù)神經(jīng)生長(zhǎng)因子。這些蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)分布在5.2～8.3之間，分子量分布在14 kDa～60 kDa之間。酸性蛋白質(zhì)最多，中性蛋白質(zhì)次之，堿性蛋白質(zhì)最少。 4．另外，6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)沒(méi)有獲得肽質(zhì)

8、量指紋(Peptide mass fingerprinting，PMF)圖譜，或者信號(hào)質(zhì)量太差，在數(shù)據(jù)庫(kù)中得不到可靠匹配，因此無(wú)法進(jìn)行鑒別。 以上結(jié)果表明，中介蝮蛇毒組分中，主要毒素的分子量分布在14 kDa-67 kDa之間。2-DE聯(lián)合MALDI-TOF MS分析，共鑒別出22種蛋白，歸屬于6個(gè)家族，分別為：Ⅲ型金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、磷脂酶A<,2>、L-廣氨基酸氧化酶、CRISP及神經(jīng)生長(zhǎng)因子。其等電點(diǎn)(pI)分布在5