睡眠剝奪后海馬蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　睡眠在人類生活中占有很重要的位置。睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由于現(xiàn)代生活及工作上的需要、周圍環(huán)境或其他無法避免的原因而不能保證正常的睡眠。睡眠剝奪對人類認知功能的影響是不容忽視的，包括清醒度、警覺性和注意力下降;學(xué)習記憶能力降低;執(zhí)行功能下降;負面情緒增加等。睡眠缺失引起的這些一系列認知功能的障礙，與睡眠缺失導(dǎo)致腦部的某些重要的功能區(qū)域及有關(guān)其功能的蛋白質(zhì)的改變密切相關(guān)。睡眠缺失后可以在海

2、馬區(qū)觀察到很多變化如神經(jīng)元的更換、凋亡，樹突和突觸的重構(gòu)，在嚙齒類動物的前額葉皮層及杏仁核也可以觀察到其他一些適應(yīng)性改變。在睡眠剝奪后海馬神經(jīng)元有明顯損傷，神經(jīng)元形態(tài)的改變直接影響其正常生理功能的發(fā)揮，睡眠剝奪可引起大鼠海馬神經(jīng)元凋亡發(fā)生。海馬是位于腦顳葉內(nèi)的一個部位，它是組成大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，擔當著關(guān)于記憶以及空間定位的作用。海馬亦是老年期癡呆患者較早發(fā)生病理改變的部位。有研究認為睡眠剝奪與很多神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，而多種神經(jīng)退

3、行性疾病均發(fā)現(xiàn)有某些致病蛋白質(zhì)的聚集，由此可知，直接對睡眠剝奪后腦組織的蛋白質(zhì)組變化的研究可更加直觀的揭示其引起的機體各系統(tǒng)變化尤其是神經(jīng)系統(tǒng)改變的病理生理機制。
　　蛋白質(zhì)是生物體基因功能活動的最終執(zhí)行者，并直接體現(xiàn)生命現(xiàn)象的復(fù)雜性以及多樣性。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的興起是進入后基因組時代的標志，它是從整體的角度來研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后修飾、蛋白與蛋白之間的作用等，并揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命現(xiàn)象之間的規(guī)律。差異蛋

4、白質(zhì)組學(xué)則是分析不同生物體在不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達的差異，為探索細胞的分子機制、疾病的病理病因及尋找治療藥物靶點提供了可能性的依據(jù)。
　　本研究通過對大鼠睡眠剝奪模型的制作，對正常對照組海馬組織和睡眠剝奪72小時后海馬組織進行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，找出表達不同的蛋白質(zhì)，從而探尋睡眠剝奪后引起一系列的蛋白質(zhì)改變，從而幫助我們進一步深入理解這些蛋白質(zhì)改變引起一系列疾病的本質(zhì)。
　　方法:
　　1、實驗分組:成年雄性Wistar

5、大鼠分為實驗組和對照組，實驗組大鼠進行72小時睡眠剝奪，對照組大鼠維持正常睡眠-覺醒周期。
　　2、制作大鼠睡眠剝奪模型，實驗組大鼠于睡眠剝奪72小時后處死，斷頭取腦，分離大腦海馬組織;對照組同樣取相應(yīng)部位腦組織，將組織放EP管中后置于-80℃冰箱中備用。
　　3、進行大鼠海馬組織蛋白質(zhì)提取并使用胰蛋白酶酶解脫鹽后待用。
　　4、將制備好的樣品肽段用TMT標記，上樣buffer溶解，膠條水化，并經(jīng)TFA酸化后進行C18

6、 Zip-Tip脫鹽。
　　5、抽干樣品后溶解、離心，并用LC-LTQ-MS/MS分析以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索。
　　結(jié)果:
　　1、成功制作大鼠睡眠剝奪模型，運用蛋白質(zhì)組學(xué)及TMT技術(shù)，比較睡眠剝奪72小時組與正常對照組海馬蛋白質(zhì)的變化，得出差異蛋白99個，其中表達上調(diào)的蛋白有65個，表達下調(diào)的蛋白有34個。
　　2、運用GeneCodis軟件分析發(fā)現(xiàn)有意義的蛋白60多個，這些蛋白主要涉及到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運及降解、突觸再生、

7、氧化應(yīng)激、細胞周期、能量代謝與細胞凋亡等生物學(xué)過程。
　　結(jié)論:
　　1、運用蛋白質(zhì)組學(xué)及TMT標記技術(shù)鑒定出大鼠睡眠剝奪后與對照組海馬組織相比差異表達蛋白涉及蛋白質(zhì)加工與降解、突觸再生及其功能、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡過程等等，而這些過程多數(shù)與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病尤其是AD發(fā)生的病理機制密切相關(guān)，提示睡眠缺失與腦老化及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可能存在潛在的聯(lián)系。從而幫助我們進一步深入理解這些疾病的本質(zhì)。
　　2、通過本實驗表明